贵州火龙果采后病害主要病原菌分离鉴定及抑菌植物精油筛选

张绿萍, 袁启凤, 解 璞, 王 宇, 王 彬

(贵州省农业科学院 果树科学研究所， 贵州 贵阳 550006)

贵州省自2001年引种火龙果，目前已成为全国主要的火龙果产区之一，其中贵州罗甸和关岭火龙果获国家地理标志产品。随着种植时间的延长和种植面积的扩大，火龙果栽培上病害发生日趋严重。而由于采前病菌侵染及采后果实衰老和抗性下降，病菌从潜伏状态转变为致病状态而引起果实发病腐烂，加重了采后病害的发生。据报道，引起上海市进口火龙果软腐致病真菌主要为尖孢镰刀菌(FusariumoxysporumSchl.)和单隔镰刀菌(FusariumdimerumPenzig in Saccardo)[1];海南火龙果采后主要病害有炭疽病〔ColletotrichumgloeosporioidesPenz.和C.capsici (Syd.)Butler & Bisby〕、根霉病〔Rhizopusstolonifer(Ehrenb.exFr.) Vuill.〕、焦腐病(Botryodiplodiatheobromaepat.)、仙人掌平脐蠕孢〔Bipolariscactivora(Petrak) Alcorn〕和革节孢菌〔Scytalidiumdimidiatum(Penz.) Sutton and Dyko〕，偶见镰刀菌果腐病(Fusariumsp.)[2];广西火龙果采后主要病害有木贼镰刀菌〔Fusariumequiseti(Corda) Sacc.〕、桃吉尔霉〔Gilbertellapersicaria(Eddy) Hesselt.〕、链格孢〔Alternariaalternata(Fr.) Keissl.〕、仙人掌平脐蠕孢〔Bipolariscactivora(Petrak)Alcorn〕、新暗色柱节孢〔Neoscytalidiumdimidiatum(penz.) Crous et Slippers〕[3];云南火龙果采后果腐病主要有科桃吉尔霉(Gilbertellapersicaria)[4]；浙江红肉火龙果采后贮藏期腐烂病主要有层生镰刀菌(Fusariumproliferatum)和平头炭疽菌(Colletotrichumfructicola)[5]。贵州作为全国最大的河谷火龙果产地和全国优质火龙果的主要输出地，调查贵州火龙果的采后病害的种类和发生情况，以及研究其绿色防治方法，对减少采后损失，延长货架期极为重要。因此，以贵州罗甸、关岭、镇宁采摘的火龙果为研究对象，应用分离培养、柯赫氏法则、形态学观察、rDNA-ITS序列分析、分离鉴定病原菌；并筛选抑制火龙果采后病害适宜的精油种类及浓度，以期为火龙果采后健康环保的防腐保鲜措施和新型保鲜剂的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 果实 火龙果品种为紫红龙和晶红龙，2013-2015年从贵州罗甸、镇宁采收，果皮表面无病害、无机械损伤。火龙果分别进行5～6℃冷藏或室温贮藏，冷库冷藏于15 d、20 d、25 d后观察采后病害发生情况，室温贮藏分别于采后5 d、7 d、9 d观察采后病害发生情况。

1.1.2 试剂 肉桂精油、生姜精油、桔子精油、丁香叶精油、丁蕾精油、罗勒精油、香根精油均为单方精油，工业生产，购于国际香精香料公司，玻璃瓶封装，4℃冰箱贮藏。培养基：PDA培养基(马铃薯葡萄糖培养基)：马铃薯浸汁200 mL；葡萄糖20 g，琼脂20 g，121℃灭菌20 min。

1.2 病原菌的分离及形态学鉴定

采用组织分离法对发病火龙果的病原菌进行分离纯化[6]，将纯化后的菌株接种于PDA培养基上，28℃倒置培养，观察菌落特征，在显微镜下观察菌丝体形态、产孢结构、孢子形态、颜色、大小等特征，进行形态学鉴定。

1.3 致病性测定

根据柯赫法则进行致病性检测。挑选健康的火龙果果实，先用清水清洗晾干，再用75%酒精对果实表面消毒，最后用无菌水冲洗3遍，晾干后备用。将从病果组织中分离纯化获得的真菌接种至PDA固体培养基上，28℃培养3～5 d备用。无伤接种：用无菌打孔器取直径6 mm的菌落块接种到果实赤道部位；有伤接种：用接种针在果实赤道部位刺伤(直径约5 mm，深度约5 mm)，接种105CFU/mL的待测菌孢子悬浮液10 μL，置于温度28℃，相对湿度90%的培养箱培养，每处理果实5个，重复3次，定期观察发病情况，显现病症后再次分离鉴定。将分离出的菌株与所接菌株的菌落形态、菌丝形态、孢子形态等进行比较，并判断是否一致。

1.4 植物精油对病原菌的抑制效果

选择已有报道的对果蔬病原菌有较好抑制效果的肉桂、罗勒、姜油、丁香叶、桔子、丁蕾、香根等7种精油，采用熏蒸法研究其对贵州火龙果提纯分离的致病微生物的抑制效果。

1.4.1 体外抑制试验 将融化的PDA培养基倒入到平板培养皿中，每个15 mL。用无菌的打孔器在病原菌(培养7 d)平板上打取直径为6 mm菌块放入平板中央，将平板倒置，取一片无菌直径为1 cm的滤纸置于平板盖子中央，根据预试验结果，用移液枪取肉桂精油2 μL、4 μL、8 μL滴于滤纸上，其他精油用移液枪取4 μL、8 μL、12 μL分别滴于滤纸上。以滤纸片不添加植物精油的平板为对照。将平板密封，放入28℃生化培养箱中培养7 d后观察抑菌效果。“十字”法测量菌落纵横径，计算抑制率，每个浓度梯度3个平板，试验重复3次。

抑制率=(C-T)/C×100%

式中，C为对照菌落面积，T为不同浓度条件下菌落面积。

1.4.2 活体抑制试验 火龙果用 75%酒精进行表面消毒，晾干后，进行有伤接种和无伤接种。有伤接种：接种4个果，重复3 次，用接种针刺伤果皮，在伤口注射配制好的仙人掌平脐蠕孢、链格孢、桃吉尔霉、层生镰刀菌、尖孢镰刀菌5种孢子悬浮液5 μL，然后用体外抑制试验中抑制效果较好的精油20 μL/L进行密闭熏蒸处理，室温贮藏4 d后用软尺测量病斑大小。无伤接种：接种30个果，在果实表面分别喷洒配制好的孢子悬浮液，用20 μL/L抑制效果较好的精油进行密闭熏蒸处理，室温贮藏7 d后观察火龙果腐烂情况。

2 结果与分析

2.1 发病情况

贵州火龙果采收后由于生理、病理、物理以及三者协同作用引起腐烂，表面着生大量微生物，主要病害为黑斑病和软腐病(图1)。

图1 火龙果贮藏期主要病害症状

2.2 病原菌分离纯化及鉴定结果

从火龙果发病部位共分离得到8株真菌，5株具有致病能力，产生典型病害症状，分别标记为HS1、HS2、HS3、HS4、HS5。其中HS3能使无伤果发病，且发病迅速，感染后3 d全果果皮腐烂，呈水浸状。另外4菌株可使伤果发病，先褪色凹陷，然后在病斑处生长接种菌丝。

2.2.1 病原菌HS1 致病菌HS1在PDA培养基上菌落为圆形，绒毛状，边缘整齐，气生菌丝白色，成熟后变为暗绿(图2-1)。分生孢子梗丛生或散生，分枝有隔，顶部常见分支或合轴式延伸，褐色。分生孢子褐色，椭圆形或倒棍棒状，表面光滑，具1～4个假隔膜，多数为2～3个假隔膜(图2-2)。回接2 d，接种处呈扩大凹陷、周围约2 cm的圆形褪色病斑(图2-3)；接种5 d病斑略为扩大，软腐，水浸状，感病中心着生大量绒毛状菌丝，外观形态与PDA培养基相似(图2-4)。参照李敏[2-3，7]特征描述，以及通过与真菌鉴定手册的形态对比，HS1病原菌鉴定为仙人掌平脐蠕孢〔Bipolariscactivora(Petrak) Alcorn〕。

2.2.2 病原菌HS2 HS2病原菌在PDA培养基菌落呈圆形，初期菌丝灰白色，后变为灰绿色，培养基底面为黑色(图3-1)。分生孢子梗直立、分枝或不分枝，淡褐色；分生孢子褐色或深褐色，呈梨形或椭圆形、卵形，形状变化较大表面光滑或有瘤(图3-2)。回接2 d，接种周围约0.5 cm的圆形褪色；接种5 d病斑呈圆形扩大，软腐，水浸状，感病中心着生灰白色绒毛状菌丝，外观形态与PDA培养基初生菌丝相似(图3-3、3-4)。参照林珊宇等[3，8-9]的特征描述，以及与真菌鉴定手册的形态对比，HS2病原菌鉴定为链格孢〔Alternariaalternata(Fr.) Keissl.〕。

2.2.3 病原菌HS3 HS3病原菌在PDA培养基上生长迅速，培养3 d即布满直径为9 cm的培养皿,菌落无色，有大量黑色点状孢子囊(图4-1);分生孢子梗透明，无隔无分枝，顶部有圆形孢子囊(图4-2)。回接2 d，病斑呈水浸状扩大、无凹陷，病斑大小约2 cm×3 cm，接种5 d整个果实呈水浸状腐烂，着生与PDA培养相似的菌丝(图4-3、4-4)。参照林珊宇等[3-4]的特征描述以及与真菌鉴定手册的形态对比，HS3病原菌鉴定为桃吉尔霉(Gilbertellapersicaria)。

图2 HS1菌落形态、菌丝及分生孢子形态、回接2 d和5 d的致病症状

图3 HS2菌落形态、菌丝及分生孢子、回接2 d和5 d的致病症状

图4 HS3菌落形态、菌丝及分生孢子、回接2 d和5 d的致病症状

2.2.4 病原菌HS4和HS5 致病菌HS4、HS5在PDA培养基上生长速度相似，且均为绒状、棉絮状白色菌丝，HS4较为致密(图5-1)，菌丝背面为淡黄色，在PDA培养基中分泌出淡黄色和红黄色色素(图5-2)。HS4的分生孢子梗为蓝绿色，着生菌丝呈短小爪状，透明有隔。分生孢子蓝色，呈长椭圆形或新月形，多数2～3个隔膜(图 5-3) 。回接2 d，接种处褪色，着生白色棉絮状菌丝(图5-4)；接种5 d，形成黄褐色、凹陷且边缘清晰，着生白色致密绒状微生物的病斑，病斑约2 cm×3 cm大小，其感病中心菌丝外观形态与PDA培养基相似(图5-5)。HS5较为疏松(图6-1),在培养基中分泌黄色至橘黄色色素(图6-1)，分生孢子淡蓝色，镰刀形，具3～5隔(图6-2)。回接2 d，接种处呈扩大凹陷、形成约1 cm凹陷、软腐圆形褐色病斑，中间着生白色菌丝(图6-3)，接种5 d病斑约为直径2 cm软腐(图6-4)，感病中心菌丝外观形态与PDA培养基相似。参照崔志婧等[1，3，5]的特征描述，以及与真菌鉴定手册的形态对比，将HS4、HS5病原菌初步鉴定镰刀菌(Fusarium)。

为进一步鉴定HS4和HS5，利用PCR方法对病原菌基因组DNA进行ITS鉴定。真菌HS4的rDNA序列扩增产物测序，经blast比对和系统发育树分析(图7)，HS4与层生镰刀菌(Fusariumproliferatum,登录号636868)的ITS序列100%同源，HS5与尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum,登录号MN181571)ITS序列的同源性为100%。

图5 HS4菌落正面和反面形态、菌丝及分生孢子、回接2 d和5 d的致病症状

Fig.5 Morphology of HS4 positive and negative forms of colony, morphology of mycelia and conidia,and pathogenic symptoms of 2 d and 5 d grafting

图6 HS5菌落形态、菌丝及分生孢子、回接2 d和5 d的致病症状

Fig.6 Morphology of HS5 colony, morphology of mycelia and conidia, and pathogenic symptoms of 2 d and 5 d grafting

图7真菌HS4和HS5的分子系统树

Fig.7 Molecular tree of fungal HS4 and HS5

2.3 植物精油对火龙果致病真菌的抑菌效果

2.3.1 体外抑菌效果 从表1看出，随着精油添加量的增加，其抑菌效果也增加。对5种病原菌的抑制效果以肉桂精油的最佳，当精油添加量为6 μL时，对HS1、HS2、HS4、HS5的抑制率均达100%。其次是罗勒和丁香叶精油，精油添加置为12 μL时，对HS1、HS2、HS4和HS5的抑制率在80%以上；香根的抑制效果也较好，抑制率在80%左右；姜油和丁蕾对病原菌有一定的抑制效果，抑制率在60%左右；桔子精油对病原菌的抑制效果最差，抑制率低于50%。肉桂精油对HS3有抑制作用，在精油添加量为6 μL时，抑制率达96.71%；罗勒、丁香叶和姜油精油对HS3病原菌的有一定的抑制效果，但效果相对较差，在精油添加量为12 μL时抑制率分别为31.48%、29.14和3.96；桔子、丁蕾和香根精油对HS3病原菌无抑制效果。

表1 不同精油对火龙果采后主要病原菌的体外抑菌率

2.4 体内抑菌效果

将对各病原菌抑制效果较好的肉桂精油熏蒸无伤接种和有伤接种的果实，结果表明(表2)，肉桂精油熏蒸处理能抑制无伤接种的腐烂率，腐烂率与对照均呈显著差异；减缓有伤接种病斑的扩大速度，病斑大小与对照呈显著差异。HS3的致病性最强，有伤接种3 d，果皮50%面积出现水浸状病斑，接种5 d全果腐烂；无伤接种4 d，50%以上果实表皮出现水浸状病斑。此外，精油直接接触果皮会造成药害。

表2 肉桂精油熏蒸接种致病菌火龙果的腐烂率及病斑大小

注：不同字母表示差异显著(P≤0.05)；有伤接种的腐烂率为100%，无伤接种的病斑不一定在接种点，因此没有测量。

Note: Different letters mean significant difference (P≤0.05). The decay rate of inoculation with wound was 100%, and the lesion without wound inoculation was not necessarily at the inoculation site, so no measurement was made.

3 结论与讨论

研究结果初步确定贵州火龙果采后主要病害致病菌为仙人掌平脐蠕孢、链格孢、桃吉尔霉、层生镰刀菌和尖镰刀菌，与广东[7]、广西[3]、海南[2]、云南[4]、浙江[5]等产区及上海市[1]进口火龙果的文献报道有部分相似之处，也与朱迎迎等[10]统计的引起在我国火龙果釆后病害的真菌相符。另外，研究首次从同一软腐病组织中分离层生镰刀菌和尖孢镰刀菌2种镰刀菌。

精油是存在于植物体内的一类可随水蒸气蒸馏且具有一定气味的挥发性油状液体的总称[11]。精油及其成分具有明显的抑菌作用，其低毒且对环境影响小，可作为传统化学杀菌剂的替代物用于果蔬贮藏保鲜[12]。植物精油作为植物源熏蒸类抑菌剂，已经用于多种果蔬采后病害控制的研究[13-15]。肉桂精油经美国食品香料和萃取物制造者协会(food spices and extract manufacturers associa-tion, FEMA)认证可作为食品香料使用，并获得美国食品药物管理局(food and drug administration, FDA)批准，FEMA号为2258，且已被纳入中国《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》GB 2760-2014，进入允许使用的食品用天然香料名单，编码为039。目前，肉桂精油在水果贮藏保鲜方面的应用已成为研究热点[16-19]。试验结果表明：7种植物精油中，对贵州火龙果采后5种致病菌的抑菌效果最好的是肉桂精油，其能有效降低腐烂率，减缓伤口病斑的扩增，试验结果与刘瑞玲等[5]的肉桂精油对浙江产区火龙果采后主要致病菌层生镰刀菌的抑制作用相一致。

研究结果可为贵州火龙果采后病害发生规律研究及进一步制定切实有效的采后病害综合防治措施提供参考和依据。同时，根据精油的体内抑菌和体外抑菌效果，肉桂精油作为火龙果贮藏前及贮藏期熏蒸杀菌剂具有较好的应用前景，但生产上应用的最适宜浓度，避免药害及有效熏蒸的放置点等参数还有待于进一步探索。