下丘脑胰岛素抵抗在多囊卵巢综合征排卵障碍中的作用

马玲，刘振华，陈皓，刘凤 (长江大学第一临床医学院 荆州市第一人民医院内分泌科，湖北 荆州 434000)

易清华 (长江大学第一临床医学院 荆州市第一人民医院妇产科，湖北 荆州 434000)

多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是由卵巢泡膜细胞良性增生引起的高雄激素血症、持续性排卵障碍和卵巢多囊性改变为主要特征的临床疾病，一般在青春期前后发病[1]。PCOS是导致育龄期妇女不孕的最常见原因之一，患病率为5%～10%[2]。该病临床表现为月经异常、肥胖等，并有高脂血症、糖尿病等多种代谢并发症，伴有明显的胰岛素抵抗(IR)[3]。国内外临床研究证实，PCOS患者中，50%～60%存在IR。1980年Burghen等首次提出IR参与PCOS的发病过程[4]。有医者研究通过生活方式干预与胰岛素增敏剂(如二甲双胍与TZD药物)治疗PCOS患者后，其能量代谢得以改善，同时卵巢排卵率也有一定程度的提高[5]。由此，学者们推测PCOS胰岛素水平升高不仅是患者能量代谢紊乱的标志信号，也是导致患者排卵障碍的关键环节[6,7]。临床上治疗效果显示，改善机体能量代谢、降低胰岛素水平能够在一定程度上提高PCOS的排卵生殖力，但作用十分有限，治疗效果并不理想[8]。最近研究发现，下丘脑胰岛素受体后IRS2/PI3K/AKT信号传导受阻(即下丘脑胰岛素抵抗)将导致机体胰岛素分泌增加[9]。笔者拟通过硫酸普拉睾酮钠诱导构建PCOS大鼠模型，探究PCOS大鼠是否也存在下丘脑胰岛素抵抗，以及改善下丘脑胰岛素抵抗能否降低PCOS胰岛素水平、促进卵巢排卵，并研究PCOS大鼠下丘脑胰岛素受体底物(IRSs)、PI3K、AKT2mRNA的影响，从而阐明下丘脑胰岛素抵抗在多囊卵巢综合征排卵障碍中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取SD雌性大鼠为研究对象，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心。50只大鼠均为3周龄，体重180～200g。

1.2 模型建立

将大鼠适应性饲养1周后， 颈背部皮下注射硫酸普拉睾酮钠溶液，9mg/100g，连续注射20d。该组大鼠在实验周期内均给予高脂饲料喂养。计算胰岛素敏感指数(insulin sensitivityindex, ISI)：

筛选造模组中ISI小于正常组ISI的均值减1.96标准差、且阴道涂片无周期变化者作为成模大鼠 ,即为造模成功[10]。正常组(24只)：颈背部皮下注射等量溶剂(共20d)，实验周期内该组大鼠均给予普通饲料喂养。

1.3 分组与给药

选择24只造模成功的SD大鼠，随机分为2组：模型对照组(12只)不进行任何给药处理；模型激活组(12只)连续皮下注射1.1μg/kg胰岛素样生长因子(IGF-1)，8周。

将正常组大鼠24只，随机分为2组：正常对照组(12只)不进行任何给药处理。抑制组(12只)大鼠每日脑室内灌注0.7mg/kg的P13K阻滞剂渥曼青霉素(Wortmannin)和11.2mg/kg的AKT抑制剂哌立福辛(Perifosine)，连续8周[11]。

1.4 体重和胰岛素及脂质代谢测定

实验结束后，各组大鼠均禁食12h，然后采用0.3mL/100g的10%水合氯醛进行腹腔注射以麻醉大鼠。腹主动脉取血后，室温下(25℃±2℃)静置20min，然后4℃离心机中3500r/min离心10min。采用相应试剂盒分别检测血清中游离脂肪酸(FFA)、甘油三酯(TG)和总胆固醇水平(TC)。

1.5 下丘脑中IRS-2含量测定[12]

上述大鼠颈椎脱臼处死后，于冰上剥取下丘脑。采用4%多聚甲醛进行固定，固定时间24h。然后采用手术刀将目的部位组织修整平，进行乙醇梯度脱水后，采用石蜡进行包埋并切片(4μm)，每个下丘脑随机选取4张切片进行IRS-2含量测定。60℃烘烤切片后，采用二甲胺和乙醇脱蜡至水。随后组织切片采用EDTA抗原修复缓冲液(pH9.0)进行微波炉抗原修复10min。自然冷却后，采用PBS(pH7.4)洗涤3次，5min/次。

采用3%过氧化氢溶液阻断组织中内源性过氧化物酶(20min)后，分别加入一抗(1∶500，5%BSA)和HRP标记的二抗，分别孵育过夜和50min。采用DAB显色后Harris苏木素复染3min，1%盐酸酒精分化数秒后氨水返蓝。最后采用乙醇梯度脱水后，采用中性树胶封片。

切片200×拍照后，采用软件Image-ProPlus6.0对照片分析，得出每张照片阳性的积累光密度(IOD值)，代表IRS-2含量。

1.6 下丘脑中PI3K和p-PI3K蛋白表达的测定[13]

1.6.1 总蛋白的提取

取各大鼠下丘脑组织1mm3，采用冷TBS洗涤2～3次后，采用10倍体积的下丘脑组织试剂(含蛋白酶抑制剂：非磷酸化/磷酸化蛋白酶抑制剂)冰上匀浆。冰浴30min后，10000r/min离心5min。收集上清，即下丘脑组织总蛋白溶液，备用。

1.6.2 Western Blot测定下丘脑中PI3K和p-PI3K蛋白表达

采用Bradford法进行蛋白浓度的测定。以牛血清白蛋白为标准品进行标准曲线的绘制。测完蛋白含量后，计算含40μg蛋白的溶液体积即为SDS-PAGE电泳的上样量。

转膜后，分别使用5%脱脂牛奶(溶剂为0.5%TBST)和5%脱脂牛奶(溶剂为5%BSA)进行非磷酸蛋白和磷酸化蛋白的检测。一抗和二抗加入后，分别4℃过夜和室温30min孵育。最后采用显影和定影试剂进行显定影。拍照后，采用Alpha凝胶图像分析软件进行目标条带的光密度值。

1.7 下丘脑中AKT2mRNA检测表达

取100mg下丘脑组织，加入1mL Trizol Reagent进行匀浆。然后加入250μL三氯甲烷，静置后10000r/min离心10min(4℃)。取上清，加入0.8倍体积的异丙醇，-20℃静置15min后，10000r/min离心10min(4℃)。弃去上清，采用1.5mL 75%乙醇洗涤后，吹干。反转录后，采用定量PCR测定AKT2基因的表达情况。

1.8 排卵生殖力检测

摘取各组大鼠双侧卵巢，用4%多聚甲醛固定，采用石蜡包埋并切片后，HE染色，采用显微镜观察。计算各组大鼠排卵率、平均排卵数和囊性扩张卵泡率[14]:

(1)

(2)

(3)

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠体重和空腹血胰岛素水平测定结果

大鼠体重测定结果汇总如表1所示。由表1可以看出，模型对照组即多囊卵巢综合征大鼠，体重显著性大于其他各组大鼠(P<0.05);抑制组即PI3K和AKT抑制组大鼠，相同培养时间时其体重显著性高于正常对照组(P<0.05);模型激活组的体重显著性低于模型对照组和抑制组(P<0.05)，但是明显高于正常对照组(P<0.05)。

表1 各组大鼠的体重

实验开始后每2周测定大鼠的空腹血胰岛素水平，测定结果汇总如表2所示。由表2可以看出，正常对照组和模型激活组的大鼠空腹胰岛素水平随着时间推移并无统计学差异(P>0.05);模型对照组即多囊卵巢综合征大鼠，随着时间推移，血胰岛素水平升高(P<0.05)，且显著高于其他各组大鼠(P<0.05);抑制组即PI3K和AKT抑制组大鼠，相同培养时间时其血胰岛素显著性高于正常对照组(P<0.05);模型激活组的血胰岛素显著性低于模型对照组和抑制组(P<0.05)，恢复到正常对照组血胰岛素水平，与正常对照组并无统计学差异(P<0.05)。

表2 各组大鼠空腹胰岛素水平

2.2 大鼠脂质代谢水平

实验结束后，各组大鼠均禁食12h后取动脉血测定脂质代谢，测定结果汇总如表3所示。由表3可以看出，抑制组、模型对照组和模型激活组的大鼠TC、TG、FFA均高于正常对照组(P<0.05);模型对照组大鼠TC、TG、FFA则均高于抑制组和模型激活组(P<0.05);抑制组大鼠TC、TG、FFA均显著性高于模型激活组(P<0.05)。

表3 各组大鼠的脂质代谢检测结果

2.3 大鼠下丘脑中IRS-2含量测定

实验结束后，各组大鼠下丘脑中IRS-2累积光密度值情况如下：正常对照组2802.76±225.88、抑制组1492.48±116.37、模型对照组277.55±633.14、模型激活组1736.49±185.49。抑制组、模型对照组和模型激活组的大鼠下丘脑中IRS-2均低于正常对照组(P<0.05)；模型对照组下丘脑中IRS-2低于抑制组和模型激活组(P<0.05)；抑制组大鼠下丘脑中IRS-2低于模型激活组(P<0.05)。

2.4 大鼠下丘脑中PI3K和p-PI3K蛋白表达的测定

实验结束后，各组大鼠下丘脑中PI3K和p-PI3K相对于β-actin的表达量测定结果汇总如表4所示。由表4可以看出，抑制组、模型对照组和模型激活组的大鼠下丘脑中PI3K/β-actin和p-PI3K/β-actin均低于正常对照组(P<0.05)；模型对照组大鼠下丘脑中PI3K/β-actin和p-PI3K/β-actin低于抑制组和模型激活组(P<0.05)；抑制组大鼠下丘脑中PI3K/β-actin和p-PI3K/β-actin低于模型激活组(P<0.05)。

2.5 大鼠下丘脑中AKT2mRNA检测

实验结束后，各组大鼠下丘脑中AKT2mRNA测定结果汇总如表4所示。由表4可以看出，抑制组、模型对照组和模型激活组的大鼠下丘脑中AKT2mRNA均低于正常对照组(P<0.05)；模型对照组大鼠下丘脑中AKT2mRNA低于抑制组和模型激活组(P<0.05)；抑制组大鼠下丘脑中AKT2mRNA低于模型激活组(P<0.05)。

表4 各组大鼠下丘脑中PI3K、p-PI3K蛋白和AKT2mRNA表达

2.6 大鼠排卵生殖力

实验结束后，各组大鼠排卵生殖力测定结果汇总如表5所示。由表5可以看出，抑制组、模型对照组和模型激活组的大鼠平均排卵数和排卵率均低于正常对照组(P<0.05);模型对照组大鼠平均排卵数和排卵率低于抑制组和模型激活组(P<0.05);抑制组大鼠平均排卵数和排卵率低于模型激活组(P<0.05);抑制组、模型对照组和模型激活组的大鼠囊性扩张卵泡率高于正常对照组(P<0.05);模型对照组大鼠囊性扩张卵泡率高于抑制组和模型激活组(P<0.05);抑制组大鼠囊性扩张卵泡率高于模型激活组(P<0.05)。

表5 各组大鼠排卵生殖力

3 讨论

下丘脑PI3K是参与细胞内信号转导的信号分子之一[15]。下丘脑PI3K催化亚基的正常表达可生成PIP2和PIP3，作用于PI3K信号通路下游的各种酶，保证了胰岛素代谢功能的正常实现[16]。AKT是作为PI3K信号通路上重要的下游分子，参与实现对机体糖代谢调解过程[17]。胰岛素受体底物(IRSs)是胰岛素信号转导通路受体后水平的重要信号蛋白。其中IRS-2参与胰岛素在中枢下丘脑的传递过程，可以影响PI3K信号通路对胰岛素的传导[18]。笔者以SD雌性大鼠为研究对象，颈背部皮下注射硫酸普拉睾酮钠溶液建立多囊卵巢综合征大鼠模型。并分为正常对照组、抑制组(Wortmannin和Perifosine阻滞PI3K/AKT通路)、模型对照组和模型激活组(皮下注射1.10μg/kg胰岛素一号增长因子IGF-1)。结果发现，模型对照组即多囊卵巢综合征大鼠，体重、空腹胰岛素水平、囊性扩张卵泡率、血清中FFA、TG和TC均大于其他各组大鼠(P<0.05)；抑制组即PI3K/AKT通路抑制组大鼠，相同培养时间时其体重、空腹胰岛素水平、囊性扩张卵泡率、血清中FFA、TG和TC均高于正常对照组(P<0.05)；模型激活组的体重、空腹胰岛素水平、囊性扩张卵泡率、血清中FFA、TG和TC均低于模型对照组和抑制组(P<0.05)，但是高于正常对照组(P<0.05)；模型对照组即多囊卵巢综合征大鼠，下丘脑中IRS-2、PI3K/β-actin、p-PI3K/β-actin、AKT2mRNA表达水平、平均排卵数和排卵率均低于其他各组大鼠(P<0.05)；抑制组即PI3K/AKT通路抑制组大鼠，相同培养时间时下丘脑中IRS-2、PI3K/β-actin、p-PI3K/β-actin、AKT2mRNA表达水平、平均排卵数和排卵率均低于正常对照组(P<0.05)；模型激活组的下丘脑中IRS-2、PI3K/β-actin、p-PI3K/β-actin、AKT2mRNA表达水平、平均排卵数和排卵率均高于模型对照组和抑制组(P<0.05)，但是低于正常对照组(P<0.05)。

单纯下丘脑胰岛素受体后IRS2/PI3K/AKT信号障碍可显著减轻胰岛素对肝糖输出的抑制作用[19]。下丘脑胰岛素受体后IRS2/PI3K/AKT信号传导受阻(即下丘脑胰岛素抵抗)将导致机体胰岛素分泌增加，进而引起大鼠下丘脑胰岛素抵抗和排卵障碍[20]。对比多囊卵巢综合征大鼠和IGF-1激活大鼠的各项生理指标，可以看出多囊卵巢综合征大鼠呈现典型的下丘脑胰岛素抵抗和排卵障碍。

综上所述，下丘脑胰岛素受体IRS2/PI3K/AKT信号传递在升高对机体胰岛素水平与降低排卵生殖力中的作用具有促进作用。