去甲斑蝥素通过Wnt/β-catenin信号通路诱导乳腺癌细胞MCF-7凋亡

殷世亮，张弘，贾丽娜，金戈，房丽娜，孟冉，吴祖倩，周雪茹，王露桐

（1.沈阳医学院基础医学院药理学教研室，辽宁 沈阳110034；2.沈阳药科大学生命科学与生物制药学院；3.沈阳药科大学药学院）

去甲斑蝥素（norcantharidin，NCTD）为芫青科昆虫南方大斑蝥或黄黑小斑鳌中有效成分斑蟊素的去1，2位甲基人工合成化合物，在临床上常被作为抗癌药物使用。临床研究结果表明NCTD对肝癌、食管癌及胃癌的发生、发展均有较强的治疗作用［1］，然而其对乳腺癌的治疗作用及其作用机制还尚不明确，亟待进一步阐明。已有研究表明Wnt/β-catenin通路的激活在乳腺癌的无限增殖、自我更新、黏附和迁移侵袭过程中发挥了至关重要的作用［2］。Wnt/β-catenin通路的激活可导致磷酸化β-catenin去磷酸化，从而使游离的β-catenin在胞浆中蓄积并进入细胞核，进而与Tcf/Lef家族 蛋 白（T cell factor/Lymphoid enhancer factor）形成转录复合物，启动下游靶基因包括MMP-7的转录，进而调控抗凋亡、细胞自我更新、迁移侵袭等细胞程序，导致癌症的发生与发展［3-6］。因此，本研究将考察NCTD对乳腺癌细胞MCF-7的凋亡诱导作用，并进一步考察其对Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的影响，以期明确NCTD对乳腺癌细胞的抗癌作用机制，为其临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人乳腺癌细胞系MCF-7（美国ATCC公司）；DMEM培养液（美国Gibco公司）；胎牛血清（美国Hyclone公司）；MTT（美国Sigma公司）；AnnexinV-FITC凋亡试剂盒（美国BioVision公司）；碘化丙啶（propidium iodide，PI）（美国Sigma公司）；β-catenin抗体、磷酸化β-catenin抗体、MMP-7抗体、β-actin抗体（美国Cell-signalling公司）；化学增强发光试剂盒（英国Amersham Biosciences公司）。去甲斑蝥素注射液由沈阳药科大学药剂教研室唐星教授惠赠。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将人乳腺癌细胞株MCF-7接种在含有10%胎牛血清和105U/L青霉素及100 mg/L链霉素的DMEM培养液中，在37℃，5%CO2培养箱内饱和湿度条件下培养。

1.2.2 MTT法行细胞成活率的测定 取对数生长期的MCF-7细胞（1×105/ml）接种于96孔培养板中，每孔100μl。加入不同浓度的NCTD（1 000、500、250、125、62.5、31.3、0μmol/L）孵育72 h后，加入MTT溶液（2.5 mg/ml），继续孵育4 h后吸去上清，加入100μl二甲基亚砜，轻柔振荡5 min后，使用酶标仪于492 nm处测定吸光度。利用下列公式求得细胞的成活率：给药组细胞吸光度的平均值/空白组细胞吸光度的平均值×100%，并计算半数有效浓度（IC50）。

1.2.3 细胞PI染色的流式细胞术检测NCTD对MCF-7细胞周期的影响 取对数生长期的MCF-7细胞（1×105/ml），接种于6孔培养板中，每孔5 ml。经不同浓度NCTD（0、50、100μmol/L）处理72 h后，离心后收集106个细胞，经70%冰冷的酒精固定过夜。然后收集样品，于1 mg/ml的RNase溶液中37℃孵育30 min后，加入相应体积的PI试剂至终浓度为50μg/ml。在4℃条件下避光染色30 min后，将细胞过200目细胞过滤网。然后利用流式细胞仪（Becton Dickinson）对样品DNA含量进行检测，PI激发波长为488 nm，吸收波长为625 nm，定量计数10 000个细胞，数据采用CELLQuest软件（Becton Dickinson）进行分析处理。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测NCTD对MCF-7细胞的凋亡诱导作用 取对数生长期的MCF-7细胞（1×105/ml）接种于6孔培养板中，每孔5 ml。加入不同浓度的NCTD（0、50、100μmol/L）孵育72 h后，每份样品按照试剂盒说明书平均分为4份，使用相同量的缓冲液重悬，第1份为空白对照，第2份加入Annexin V-FITC 5μl，第3份加入PI 5μl，第4份加入FITC和PI各5μl。室温下避光孵育5 min，使用400目细胞过滤网过滤，上流式细胞仪检测。

1.2.5 Western blot法检测NCTD对MCF-7细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的影响 取对数生长期的MCF-7细胞（1×105/ml）接种于75 ml细胞培养瓶中，每瓶10 ml。加入不同浓度的NCTD（0、25、50、100μmol/L）孵育72 h后，收集细胞。细胞内的蛋白样品（45μg蛋白）通过RIPA裂解缓冲液（50 mmol/L Tris盐酸、150 mmol/L氯化钠、0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）、1%NP-40、0.5%脱氧胆酸钠、1 mmol/L PMSF、100μmol/L leupeptin和2μg/ml aprotinin，pH 8.0）裂解得到。Bradford方法定量蛋白后，利用非连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳将裂解得到的蛋白样品进行分离，再通过电转移装置将蛋白转移到硝酸纤维素膜上。用0.2%丽春红染色液对膜染色以确定各孔道的蛋白是否等量上样并是否成功转移至膜上。5%的脱脂奶粉对膜封闭后，将一抗用1%的脱脂奶粉1∶1 000稀释。随后将硝酸纤维素膜孵育待测蛋白的特异性抗体，于4℃过夜。用TBST洗膜3次，每次10 min，随后将二抗用1%的脱脂奶粉1∶2 000稀释，室温孵育硝酸纤维素膜1 h。用TBST洗膜3次，每次10 min，随后在暗室中在硝酸纤维素膜上含有蛋白的一面滴加免疫印迹化学发光试剂（ECL kit，Amersham Biosciences）后，蛋白条带可经X光片（放射自显影片）感光记录。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0软件进行统计学分析，采用单因素方差分析及Dunnett-t检验进行数据分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NCTD可显著降低MCF-7细胞的成活率 MTT结果显示，NCTD作用于MCF-7细胞72 h后，其在1 000、500、250、125、62.5μmol/L浓度下均可显著降低MCF-7细胞的成活率（P＜0.01），其IC50值为（100.73±3.17）μmol/L。见图1。

2.2 NCTD对MCF-7细胞周期的影响 PI染色的流式细胞术结果显示，与空白对照组处于G0/G1期细胞百分比［（72.59±1.09）%］比较，50、100 μmol/L NCTD组细胞G0/G1期分布情况分别为（55.23±2.40）%、（39.74±6.61）%，差异均有统计学意义（P＜0.01）；50与100μmol/L NCTD组处于G0/G1期细胞百分比比较差异亦有统计学意义（P＜0.01），呈浓度依赖性。与空白对照组处于G2/M期细胞百分比［（5.67±0.71）%］比较，50、100 μmol/L NCTD组细胞G2/M期分布情况分别为（15.69±1.06）%、（33.07±2.21）%，差异均有统计学意义（P＜0.01）；50与100μmol/L NCTD组细胞G2/M期分布情况比较差异亦有统计学意义（P＜0.01），呈浓度依赖性。见图2。

图1 NCTD对MCF-7细胞成活率产生的影响

图2 NCTD对MCF-7细胞周期（G0/G1期和G2/M）分布情况的影响

2.3 NCTD对MCF-7细胞凋亡百分比的影响 Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术结果显示，与对照组的早期凋亡率［（5.87±0.41）%］比较，NCTD作用72 h后，50μmol/L NCTD组的早期凋亡率为（10.77±3.03）%，差异无统计学意义（P＞0.05）；100μmol/L NCTD组的凋亡率为（15.10±3.63）%，差异有统计学意义（P＜0.05）。与对照组的晚期凋亡率（2.48±0.99）%比较，NCTD作用72 h后，50 μmol/L NCTD组的晚期凋亡率为（6.21±4.53）%，差异无统计学意义（P＞0.05）；100μmol/L NCTD组的凋亡率为（12.44±3.21）%，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

图3 NCTD对MCF-7细胞的凋亡诱导作用

2.4 NCTD对Wnt信号通路相关蛋白的影响Western blot法结果显示，NCTD可显著降低MCF-7细胞中β-catenin的蛋白表达水平，升高磷酸化βcatenin的蛋白表达水平。浓度分别为0、25、50、100μmol/L的NCTD作用72 h后，MCF-7细胞中磷酸化β-catenin/β-catenin的蛋白表达量比值分别为0.041、0.198、0.777和0.973；NCTD还可显著降低β-catenin下游蛋白MMP-7的蛋白表达水平。见图4。

3 讨论

NCTD是我国首先合成的抗癌药物，其在临床上常被用于治疗消化道肿瘤。多年临床研究结果表明NCTD对消化道肿瘤如肝癌、食管癌、胃癌的疗效良好［7-8］，本研究首先采用MTT法考察了NCTD对乳腺癌细胞系MCF-7细胞成活率的影响。研究结果表明，与对照组相比，浓度为62.5、125、250、500、1 000μmol/L的NCTD作用72 h，均可显著降低乳腺癌细胞MCF-7的细胞成活率，且呈浓度依赖性。其IC50值为（100.73±3.17）μmol/L，即NCTD可浓度依赖地降低乳腺癌MCF-7细胞的成活率。

图4 NCTD对MCF-7细胞Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的影响

随后细胞周期测定以及AnnexinV-PI双染的实验结果表明，NCTD可显著降低MCF-7细胞的G0/G1期细胞百分比，升高MCF-7细胞的G2/M期细胞百分比，且呈浓度依赖性。且AnnexinV/PI双染流式细胞术的研究结果表明，100μmol/L NCTD可显著升高MCF-7细胞的早期凋亡和晚期凋亡百分比，这表明NCTD降低MCF-7细胞成活率的机制可能是通过诱导MCF-7细胞发生凋亡。

已有研究表明，Wnt/β-catenin通路的激活在乳腺癌细胞的自我更新、迁移侵袭过程中发挥了至关重要的作用［9-12］。尤其是β-catenin，在整个事件中起到一个核心的作用。Wnt/β-catenin通路的激活可抑制GSK-3β的对β-catenin的磷酸化作用。Wnt/β-catenin通路激活所导致的胞浆中磷酸化β-catenin/β-catenin比值减低极有可能是导致乳腺癌细胞抗凋亡、干细胞自我更新以及迁移侵袭的罪魁祸首，这同时也说明β-catenin具有成为抗乳腺癌治疗靶点的潜力——如果降低胞浆内β-catenin的浓度，升高磷酸化β-catenin的浓度就有可能诱导乳腺癌干细胞发生凋亡。

本研究Western blot结果表明NCTD可升高MCF-7细胞中磷酸化β-catenin的蛋白水平，并降低游离β-catenin的蛋白表达水平，显著升高了磷酸化β-catenin/β-catenin的蛋白表达比值。这表明NCTD作用后，游离β-catenin在MCF-7细胞中的蓄积明显降低。Western blot结果也进一步证实，NCTD作用后β-catenin蛋白的下游通路蛋白MMP-7的蛋白表达水平也有所下降。因此本研究结果提示，NCTD可能通过Wnt/β-catenin通路诱导MCF-7细胞发生凋亡。