木犀草素抗炎机制的研究进展

于倩，巫冠中

(中国药科大学药理教研室，江苏 南京 210009)

木犀草素是存在于许多药用植物中的黄酮化合物，是植物中最丰富的次级代谢产物之一，并且具有各种药理活性。木犀草素(3,4,5,7-四羟基黄酮)作为一种天然黄酮类物质，存在于多种蔬菜，水果和药用植物中，其中包括西兰花、洋葱叶、胡萝卜、辣椒、卷心菜、苹果皮和菊花等[1]。据报道，木犀草素具有抗氧化，抗微生物，抗炎，化学预防，化学治疗，心脏保护，抗糖尿病，神经保护和抗过敏的特性[2]。木犀草素的多种药理活性被证实与其抗炎作用有关。同时，含有高木犀草素含量的中药一直在伊朗和巴西用于治疗炎症相关的疾病[3]。

天然来源的化合物通常是先导化合物的一部分。事实上，目前有100多种天然产物的衍生药物正在进行临床试验[4]。 黄酮类化合物，特别是来自多种具有传统治疗作用植物中木犀草素，其抗炎活性一直广受关注。此外，由于木犀草素在微摩尔浓度下即显示较强的抗炎活性[5]，因此它已成为一种潜在的抗炎化合物，可用于进一步开发。一些研究报道了木犀草素的构效关系，以确认其发挥抗炎作用的机制，但是其发挥抗炎作用的相关机制尚未完全阐明，本文将对木犀草素的抗炎机制予以综述。

1 氧化应激

在炎性环境下，氧化应激和炎症是相互依赖和相互关联的共存关系。炎性细胞在炎症部位释放活性氧(ROS)，导致氧化损伤。同时，过多的ROS和氧化应激产物会进一步增强促炎反应[6]。木犀草素作为一种天然类黄酮化合物，其结构含有一定数目的酚羟基，使其具有较强的还原性，从而具有抗氧化特性。研究证实木犀草素可作为ROS清除剂，抑制ROS的产生并活化相关的抗氧化酶。同时，木犀草素可以通过减少一氧化氮合酶(iNOS)的合成，从而减少NO的生成[7]。Seelinger等[5]认为木犀草素可以通过抑制iNOS的作用，iNOS的表达和一氧化氮(NO)的生成。

据报道，在肿瘤坏死因子(TNF-α)诱导造成人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤后使用木犀草素处理，HUVECs中乳酸脱氢酶(LDH)合成减少，超氧化物歧化酶(SOD)活性增强和细胞内谷胱甘肽(GSH)水平升高，从而抑制TNF-α诱导的ROS的产生(6)。在脂多糖(LPS)和叔丁基氢过氧化物(t-BHP)诱导的巨噬细胞中，木犀草素以浓度依赖性方式抑制ROS和NO的生成[8]。还有在来自在来自Sprague-Dawley(SD)大鼠的骨髓来源的巨噬细胞中，木犀草素以剂量依赖性方式抑制TNF-α和IL-6的产生，并缩短了TNF-α和IL-6 mRNA的半衰期[9]。

此外，一些研究人员对木犀草素和其他物质的联用进行了研究。 木犀草素和橘皮素的联用对LPS刺激的NO产生良好的抑制活性，并且两者之间具有协同作用[10]。 对前列腺素E2(PGE2)，白介素(IL)-1β和IL-6的产生也观察到这种协同抑制[10]。 橘皮素和木犀草素单独使用时均会抑制iNOS和环加氧酶-2(COX-2)mRNA的表达水平，橘皮素和木犀草素的联用后对这两种酶mRNA的表达水平抑制更强[10]。与木犀草素和菊苣酸的联用也可协同抑制RAW264.7细胞中的iNOS、环氧化酶-2(COX-2)、TNF-α和IL-1β的产生[11]。总之，大量研究表明木犀草素可以通过减少活性氧和活性氮的产生，从而发挥抗炎作用。

2 细胞因子

在炎症反应期间，免疫细胞可以分泌多种类型的介质，其中包括细胞因子(例如干扰素、白介素和肿瘤坏死因子)、趋化因子(例如单核细胞趋化蛋白1)、类十二烷酸(例如前列腺素和白三烯)等[12]。这些炎症介质可以消除侵入的外来病原体并启动免疫调节。但在慢性炎症的发展过程中，长期高水平的促炎介质可造成细胞和组织不同程度的损伤[13]。无论是急性炎症还是慢性炎症，细胞因子都在其中发挥着至关重要的调节作用[14]。在缓解炎症的过程中，减少炎性细胞因子和炎症介质的生成并抑制其相关功能是极其重要的，抗炎药物的主要作用之一便是能够调节炎性介质。木犀草素的抗炎作用一部分是通过调节炎症介质实现的，并在多种体内和体外模型中显示其调节炎性因子和炎症介质的作用。木犀草素能够抑制IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、TNF-α、干扰素(IFN)-β和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，并且能够提高IL-10(一种抗炎细胞因子)的水平。此外，木犀草素还可以抑制能够控制免疫细胞迁移和定位的趋化因子(如：CCL2、CXCL2、CXCL8和CXCL9)等[15]。

3 花生四烯酸代谢途径

目前已知花生四烯酸至少有3条代谢通路，而木犀草素对其中环氧化酶和脂氧酶两条通路均有不同程度的影响。花生四烯酸可通过COX-1/2先形成不稳定的环内过氧化物(PGG2和PGH2),然后在多种酶的作用下生成两类化合物：前列腺素类(如PGE2和PGD2)和血栓素类(如TXA2和TXB2)。在炎症反应中，PGE2可通过调节免疫细胞的分化或增加相关细胞因子的表达起到促炎作用，从而加剧炎症反应[16]。而PGD2作为一种促炎因子，可以促进炎症发生，并在哮喘的发病过程中发挥至关重要的作用[17]。多个实验研究表明，木犀草素可通过抑制COX-2的表达从而减少PGE2的生成。同时，木犀草素还可以减少肥大细胞释放PGD2[18-19]。据报道，小鼠口服木犀草素(10和50 mg·kg-1)可有效抑制角叉菜胶诱导的足肿胀，RT-PCR结果显示木犀草素是COX-2 mRNA的选择性抑制剂[20]。在LPS诱导的RAW264.7的细胞内，木犀草素可以显著抑制COX-2的蛋白表达，且明显降低PEG2的水平[21]。此外，花生四烯酸也可以由脂氧酶催化生成白三烯，白三烯作为一类具有高度活性的炎症介质，参与多种疾病进程。而木犀草素可以抑制白细胞三烯(LTB4)的合成并减少肥大细胞释放白三烯[22]。

4 NF-κB 信号通路

核因子-κB(NF-κB)作为一种重要的转录调控因子可以调节多种促炎因子基因的表达，其中包括细胞因子，趋化因子和黏附分子等。在静息状态下，NF-κB二聚体与κB抑制蛋白(IκB)形成复合体并以失活状态存在于细胞质中。当细胞受到刺激后，IκB激酶复合体(IKK)活化后会将IκB磷酸化，使NF-κB从失活状态活化并暴露核定位位点游离的NF-κB从细胞质转移到细胞核内，通过与特异性κB 序列结合而诱导靶基因的转位[23]。NF-κB在炎症中发挥极其的重要作用，而许多相关研究已证明木犀草素的一部分抗炎作用是通过抑制NF-κB信号传导实现的。具体来说，木犀草素可以通过作用于多种信号分子，其中包括抑制AKT磷酸化，抑制IκB降解，抑制NF-κB亚基易位，以及改变HDAC和HAT的活性来影响NF-κB信号传导途径。

研究发现木犀草素通过减弱IκBα和p65的磷酸化来降低NF-κB的活性。在佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)和A23187共同刺激的肥大细胞(HMC-1细胞)中，木犀草素可以抑制IκBα降解和p65 NF-κB的核转位[18]。除此之外，在TNF-α刺激的HUVECs中，木犀草素以剂量依赖的方式降低IκBα的磷酸化，并且能够阻断部分NF-κB/p65的易位[24]。同时，木犀草素可以通过抑制蛋白激酶B(AKT)磷酸化从而降低炎症介质的表达。Li等[25]发现木犀草素以浓度依赖性方式降低LPS诱导的AKT磷酸化。另一报道指出，木犀草素可使磷酸化AKT的浓度依赖性降低，而非磷酸化AKT的水平未改变[26]。此外，木犀草素还可以通过改变组蛋白去乙酰化酶(HDAC)和乙酰化酶(HAT)的活性来抑制炎症。研究报道当THP-1处于高糖环境时，木犀草素通过提高HDAC的活性并降低HAT的活性来抑制NF-κB介导的染色质乙酰化，从而减少细胞因子的转录[27]。

此外，木犀草素和菊苣酸的联用明显抑制了LPS刺激的RAW 264.7细胞中p65和IκBα的磷酸化[11]。 对木犀草素衍生物的研究表明，木犀草素可以抑制p65和c-Jun的磷酸化，而木犀草素-7-O-葡萄糖苷仅抑制p65的磷酸化;在LPS刺激的RAW264.7细胞中观察到类似的核转位(木犀草素可以抑制NF-κB和AP-1的活化，但木犀草素-7-O-葡萄糖苷仅抑制NF-κB活化[28]。 因此，木犀草素比木犀草素-7-O-葡糖苷更强烈地抑制NF-κB的活化[28]。 木犀草素或木犀草素与绿原酸联用会显著抑制IL-1β刺激的RSC-364细胞中p-IKKα/β和NF-κBp50水平[27]。总之，木犀草素通过抑制NF-κB的活化来调节NF-κB信号传导途径，从而抑制促炎基因表达。

5 MAPK和AP-1信号通路

丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)属于细胞内一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。据报道，在多种细胞模型中，木犀草素可以调节MAPK信号传导途径的多种靶标。在SW982细胞中，观察到木犀草素可以抑制IL-1β诱导的c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38激酶活化，这证明了木犀草素对MAPK传导途径有一定的影响[29]。同时，木犀草素也抑制了IL-1β引起的AP-1核转位[29]。Kang等[18]报道在PMA和A23187刺激的HMC-1细胞中，木犀草素抗炎通过减少ERK和JNK的活化来抑制促炎细胞因子和细胞内Ca2+释放。其中细胞内Ca2+水平的增加可通过激活钙调蛋白和钙调神经磷酸酶来调节活化T细胞(NFATs)核因子的核转位[22]。 随着二酰基甘油(DAG)的产生，Ca2+的积累可以调节蛋白激酶C(PKC)的活化，从而介导下游信号通路的激活，包括MAPK通路和转录因子NF-κB[22]。

但是在不同的细胞类型和实验模型中，木犀草素有时显示出不同的实验结果。例如，在LPS刺激的RAW264.7细胞中，Lee等[23]发现木犀草素不抑制JNK或ERK的磷酸化，而且木犀草素对MAPK的活化没有影响，但却以时间和剂量依赖性方式降低了LPS诱导的AKT磷酸化。同时，另一研究也认为用木犀草素处理RAW264.7细胞不会改变LPS诱导的MAPK信号传导，但是却依然可以观察到JNK磷酸化降低和下游c-Jun信号传导的减弱[30]。木犀草素降低了c-Jun和AKT的蛋白质水平，但是对它们的基因水平没有影响[30]。此外，木犀草素降低了c-Jun和AKT的半衰期，并且阻断了热休克蛋白90(HSP90)与AKT的结合。由此，他们认为木犀草素是通过抑制高迁移率族蛋白1(HMGB1)的表达，并抑制c-Jun和AKT的作用来产生抗炎作用[30]。

6 JAK-STAT信号通路

木犀草素可以降低STAT的结合活性，STAT1的磷酸化水平，IRF-1(一种调节促炎细胞因子表达的转录因子)的基础表达水平，并下调因为LPS/γ-干扰素(IFN-γ)刺激所引起的IRF-1表达水平的增加[31]。木犀草素对LPS/IFN-γ刺激所引起的JAK1、JAK2和Tyk2磷酸化没有显著影响，但是在BV-2小胶质细胞中观察到Src磷酸化的减弱[31]。此外，木犀草素处理BV-2小胶质细胞时，细胞因子信号传导抑制蛋白(SOCS)-3的表达上调，表明木犀草素也可以通过影响这种负调控因子来使STAT1失活[31]。另有报道发现，在细胞因子刺激的HT-29细胞中，木犀草素可以降低全细胞裂解产物和细胞核裂解产物中STAT1(Tyr701)的磷酸化水平[25]。在RAW264.7细胞中，木犀草素显著下调IFN-γ刺激所引起的COX-2，磷酸化STAT1(Y701)和磷酸化STAT3(Y705)表达的增加;但是STAT1和STAT3总体水平却保持不变。因此，木犀草素的一部分体外抗炎作用是通过抑制STAT1和STAT3信号传导途径实现的[32]。

有研究表明，木犀草素对STAT1和STAT3的抑制具有浓度依赖性。在感染了伪狂犬病病毒(PRV)的RAW264.7细胞中，通过检测相关炎症基因(启动子中具有STAT结合序列)的表达，Liu等[26]发现木犀草素可以降低细胞中IL-6和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的分泌。他们认为木犀草素减少PRV感染的RAW264.7细胞中促炎介质NO，iNOS和COX-2的产生，部分是通过抑制STAT1/3依赖的NF-κB途径实现的。木犀草素-7-O-葡萄糖苷对STAT3或SIRT的稳态水平没有影响。类似地，木犀草素-7-O-葡糖苷不影响由IL-22和IL-6处理诱导的STAT3磷酸化[33]。然而，有趣的是，木犀草素-7-O-葡萄糖苷似乎阻止IL-22易位至细胞核[33]，尽管它对STAT的去乙酰化没有影响[33]。此外，研究发现木犀草素或者木犀草素与绿原酸联用均可下调p-STAT3的水平，而且JAK1和糖蛋白130(gp130)的水平也显著下降[27]。

7 肥大细胞

肥大细胞作为免疫系统的一部分，与多种炎症性疾病密切相关。肥大细胞发挥其生理病理功能是通过释放一系列的促炎性介质所产生的，这些介质包括组胺，细胞因子，趋化因子和蛋白(包括肥大细胞特异性糜酶和类胰蛋白酶)颗粒[34]。这些炎性介质可进一步加剧反应区域的炎症进程，因此抑制肥大细胞释放相关炎性介质可缓解某些炎症性疾病的发生发展。而木犀草素作为天然黄酮类物质，具有潜在的抗炎抗氧化和抑制肥大细胞的作用。在HMC1(人肥大细胞)中，木犀草素以浓度依赖的方式降低TNF-α、IL-6、IL-8、GM-CSF、TNF-α和COX-2的基因水平和蛋白质水平，并减少细胞内Ca2+释放，从而抑制肥大细胞释放颗粒物质[18]。木犀草素也可以抑制大鼠腹膜肥大细胞释放组胺等物质[35]。研究发现，缺糖缺氧环境会促进MC/9(小鼠肥大式细胞)脱颗粒，但木犀草素和棕榈酰乙醇酰胺联用可以明显抑制MC/9脱颗粒的进行[36]。

8 展望

科研工作者对木犀草素的抗炎活性已进行了大量的研究，并已证明其在多种细胞和动物模型中均表现出显著的抗炎活性。此外，Theoharides等[37]报道了有关木犀草素临床试验的初步研究。他们制造了膳食类黄酮制剂，该制剂主要含有木犀草素(100 mg，来自洋甘菊，纯度>95%)、槲皮素(70 mg，来自槐花，纯度>95%)和槲皮素糖苷芦丁(30 mg，来自槐花，纯度>95%)，这些化合物配制成微球(脂质体)混合在橄榄仁油中，油酸和含水量低(<0.1%)，这样会有利于吸收。37名受试者是来自美国各地患有自闭症谱系障碍(ASD)的儿童(29名男孩和8名女孩，年龄4～14岁)。儿童接受2粒/20 kg体重(每粒胶囊含有200 mg总黄酮)至少持续4周的试验[37]。这项初步研究显示，约75%的儿童胃肠道和过敏症状显著改善，50%的儿童注意力得到提升等[37]。这个发现揭示了木犀草素作为抗炎药用于治疗人类疾病的潜在用途，因为脑炎症与神经精神疾病(包括ASD)的发病机制有关。但是，迄今为止的临床研究仅限于ASD的临床评估，因此，其他炎症相关病症也必须进行广泛的研究，例如特应性皮炎，类风湿性关节炎，牛皮癣和克罗恩病。

综上所述，木犀草素可以通过多种途径缓解炎症反应，其中包括减少活性氧和活性氮的生成，影响花生四烯酸的代谢和多种炎性信号通路(NF-κB 信号通路；MAPK和AP-1信号通路；JAK和STAT信号通路)抑制炎性细胞因子和炎症介质的表达等。但目前我们对木犀草素的研究还存在局限性，一方面其抗炎机制尚未完全阐明，另一方面其安全性亟待充分的毒理学评价。因此通过对木犀草素抗炎机制及其毒理学的进一步研究，有助于为木犀草素成为抗炎新药提供依据。