复合菌系预处理和强化对玉米秸秆沼气发酵效率的影响

2019-12-06祝其丽王彦伟谭芙蓉代立春胡国全何明雄

中国沼气 2019年4期

祝其丽, 王彦伟, 谭芙蓉, 吴波, 代立春, 胡国全, 何明雄

(1.农业部农村可再生能源开发与利用重点实验室农业部沼气科学研究所，成都 610041； 2.国家成都农业科技中心, 成都 610041)

能源危机和环境污染已成为当今世界发展的两大难题[1]，而以秸秆为主要原料的生物质沼气发酵技术是有效缓解该问题的关键技术之一[2]。但由于秸秆等木质纤维素原料结构复杂、致密，难以水解酸化，致使目前秸秆沼气化利用效率较低[3]，严重制约了秸秆类农业废弃物资源化利用进程。因此，深入开展秸秆沼气发酵效率提升技术研究对解决秸秆沼气化利用技术瓶颈具有重要意义。

研究表明，预处理技术可以促进木质纤维素的水解，从而有利于提高沼气发酵效率[4]。如芦苇经蒸汽爆破预处理后的甲烷产量提高了89%[5]，水稻秸秆经真菌处理后的甲烷产量提高了78.3%[6]。目前，应用最为广泛的木质纤维素预处理方法主要分为物理、化学、生物3类[7]。其中，生物预处理因具有能耗小、成本低、环境友好等特点受到了广泛关注[3]。而复合菌系作为一种有效的生物预处理方法，能够充分发挥不同功能微生物之间的协同作用，解除代谢产物的反馈抑制，促进纤维素转化[8-9]。由于在大多数情况下，木质纤维素原料灭菌不是必需的，这可以帮助降低成本和节省时间，因此复合菌系用于预处理对于大规模生物质生产是有利的[3-4,10]。目前研究报道用于降解木质纤维素的复合菌系主要分为两类[11]：一类是从特殊环境中直接获得的，如瘤胃液、厌氧消化液等。第二类是从自然环境(土壤、污泥等)中筛选分离构建的，也是目前研究较多的一类复合菌系，如MC1[4,12-13],WSD-5[14],WSC-6[15],XDC-2[16],MCHCA[17]等，研究表明这些复合菌系均能不同程度地提升秸秆纤维素生物质沼气发酵效率。

生物强化，是指通过向生物系统添加选择的菌株或混合培养物而用于改善难降解的有机物分解代谢，近年来作为旨在提高生物燃料产物产量的替代方法，例如乙醇，氢气和甲烷[11]。与旨在改善木质纤维素材料生产沼气的生物预处理方法相比，生物强化技术具有一定的优势，包括需要更少的时间，更低的成本，更少的干物质损失和毒性划界[11, 18]。根据最近的研究，生物强化技术被证实可加速酸化，进一步改善木质纤维素材料的沼气发酵[19-20]。

目前已有研究不同复合菌系预处理对木质纤维素生物质沼气发酵效率的影响[7]，以及不同生物强化处理对沼气发酵的影响[19,21]。然而，少有关于复合菌系预处理和生物强化处理对木质纤维素生物质沼气发酵效果的比较研究。基于此，本文利用人工构建的复合菌系处理玉米秸秆，开展复合菌系预处理和强化对其沼气发酵效率提升作用的比较研究，旨在为后续筛选和优化高效降解纤维素生物质的微生物处理技术，解决我国当前秸秆沼气工程面临的技术瓶颈提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

玉米秸秆：取自四川省成都市郊区农田，取回的玉米秸秆在自然条件下风干后粉碎至约5 mm备用，其成分组成如表1。

厌氧活性污泥：取自农业部沼气科学研究所微生物实验室，其理化特性如表1。

好氧复合菌系AMC：通过实验室刚果红初筛，测定纤维素酶活及拮抗实验，构建了包括Paenibacilluscucumis1株(分离于竹虫肠道)，Bacillusaltitudinis2株(分离于瘤胃液),Bacillussubtilis3株(分离于土壤),Lysinibacillushalotolerans1株(分离于瘤胃液)等7株菌株的复合系。

厌氧复合菌系ANMC：以竹虫肠道为样本连续传代富集培养至21代，梭菌属(Clostridumsp.)为主要类群且群落结构稳定的复合系。

表1 玉米秸秆和厌氧活性污泥的特征 (%)

注：N.D.未检测。

培养基：KH2PO41.0 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaNO32.5 g，FeCl30.01 g，CaCl20.1 g，H2O 1 L，另添加0.5 g·L-1的纤维素类物质。

1.2 秸秆预处理

将5 g玉米秸秆加入装有100 mL培养基的250 mL锥形瓶中，另加入10 mL好氧复合菌液(接种量10%)，在30 ℃，160 rpm条件下处理3 d，即为秸秆预处理液，取样测定处理后秸秆中纤维素、半纤维、木质素含量，同时进行电镜扫描分析。

1.3 厌氧发酵

将秸秆按1∶1(VS)接种厌氧活性污泥进行批式发酵试验，试验采用500 mL发酵瓶，试验设计分为3组：好氧处理组(AMC)：秸秆预处理液(5 g玉米秸秆+100 mL培养基+10 mL好氧复合菌液)+235 g厌氧活性污泥；厌氧处理组(ANMC)：5 g玉米秸秆+100 mL培养基+10 mL厌氧复合菌液+235 g厌氧活性污泥；对照组(Ctrl)：5 g玉米秸秆+100 mL培养基+10 mL超纯水+235 g厌氧活性污泥；同时设置空白组。厌氧发酵温度为中温35 ℃±2 ℃，每个处理3个重复。

1.4 分析方法

1.4.1 常规理化指标分析

物料TS和VS的测定参照美国水和废水监测标准方法[22]；纤维素、半纤维、木质素含量的测定采用美国国家可再生能源实验室(NREL)标准分析方法[23]；总C和总N含量的测定采用有机元素分析仪(EAI CE440)进行分析。

厌氧发酵日产气量采用排水集气法测定；甲烷含量采用气相色谱仪(GC122)分析，色谱柱为碳分子筛TDX-01，长度2 m，内径2 mm，采用200 μL 定量环进样，检测器为TCD，色谱条件如下：柱箱温度120 ℃，进样器温度120 ℃，检测器温度150 ℃，载气为H2。

挥发性脂肪酸(VFA)浓度的测定：采用气相色谱仪(GC102)分析，色谱柱为长度1.5 m，内径2 mm的GDX-104填充柱，采用FID检测器，色谱条件如下：柱箱温度160 ℃，进样器温度210 ℃，检测器温度230 ℃，载气为N2，进样量为1 μL，H2流量30 mL·min-1，空气流量为300 mL·min-1。

1.4.2 酶活分析

单株菌株和复合菌系分别在改良赫奇逊无机盐培养基HM(KH2PO41.0 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaNO32.5 g，FeCl30.01 g，CaCl20.1 g，CMC-Na 5 g，H2O 1 L)30 ℃培养3 d后，8000 rpm离心10 min，上清液作为粗酶液，纤维素酶活性的测定采用DNS法[24-25]。本文分别对羧甲基纤维素酶、纤维二糖酶和滤纸酶的活性进行比较测定。滤纸酶活性的测定用 Whatman1号滤纸(1 cmx6 cm)条为底物，羧甲基纤维素酶活力的测定用1% 羧甲基纤维素钠为底物，纤维二糖酶活力的测定用2%水杨素为底物。各底物分别采用pH 值为4.8的醋酸-醋酸钠缓冲(0.2 mol·L-1)。取稀释酶液0.5 mL与1 mL上述底物及滤纸条充分混匀，在50 ℃水浴中温育30 min，40 min，60 min后，加入DNS 显色剂2 mL，沸水浴显色10 min，流水冷却，在540 nm下测定OD值，每测定重复3次，取平均值，同时设空白对照。以试验条件下酶液蛋白含量在单位时间内酶促反应产生的还原糖(葡萄糖)量计算酶活性[25]。

1.4.3 扫描电子显微镜观察

取少量预处理前后的秸秆样品，制样，用日本HITACHI TM-1000型扫描电子显微镜进行扫描，放大500倍观察。

2 结果与讨论

2.1 玉米秸秆预处理前后木质纤维素含量变化

纤维素降解率是表征秸秆生物质经预处理后生物降解特性的指标之一。表2所示为预处理前后玉米秸秆的木质纤维素含量及降解率。玉米秸秆经好氧复合菌液预处理3 d后纤维素、半纤维素、木质素含量为0.25，0.23，0.14 g·g-1，相比对照分别下降了16.7%，17.9%，12.5%，说明本试验构建的好氧复合菌系AMC具有一定的纤维素降解性能。其中，半纤维的降解率大于纤维素，这是因为半纤维素主要的组成物质为易降解的糖类物质，包括木聚糖，葡糖醛酸氧基，阿拉伯木聚糖，葡甘露聚糖和木葡聚糖，与纤维素相比，其结构和组成的可变性增加，预处理过程中具有相对较高的降解速率[26]。因此，与纤维素相比，半纤维素显示出相对容易水解，产生的单糖和乙酸能够进行生物转化以生产沼气和其他有用的副产物[27]。而纤维素是由通过β-1-4糖苷键连接的葡萄糖单元组成的聚合物[28]，并且被木质素包裹，使其更难水解。木质素是一种复合的多苯基芳族化合物，通过酯键连接，它紧密结合纤维素和半纤维素，形成植物的一级和二级细胞壁[27]。此外，木质素对降解具有抗性，并且是有效利用纤维素和半纤维素的障碍[29]。因此，复合菌系预处理的目的是破坏木质纤维素结构，这有助于改善水解过程，进一步促进木质纤维素生物质的沼气发酵效率。

表2 复合菌系AMC预处理秸秆前后木质纤维素含量变化

2.2 酶活分析

纤维素分解是在多种纤维素酶的协同作用下完成的，是一个复杂的生物学过程[30]。因此，本试验选取了3种常用的酶，对其活性进行分析，包括滤纸酶、羧甲基纤维素酶和纤维二糖酶[31]。其中，最能反映纤维素分解能力的指标是滤纸酶活[30]。分析结果如表3所示，本研究所构建的好氧复合菌系的滤纸酶活、羧甲基纤维素酶活、纤维二糖酶活分别为0.33 U·mL-1，1.69 U·mL-1，0.013 U·mL-1，均高于单菌酶活的上限值。这一结果与复合菌系对木质纤维素的分解能力远高于单一菌株的研究结论是一致的[32]。

表3 单菌与人工构建复合菌系AMC的酶活 (U·mL-1)

项目单菌酶活复合菌系酶活滤纸酶 0.05～0.170.33羧甲基纤维素酶0.3～0.81.69纤维二糖酶 0～0.010.013

2.3 电镜扫描分析

利用好氧复合菌系AMC预处理玉米秸秆前后的表观形态结构变化如图1和图2所示。未经预处理的玉米秸秆表面结构紧密规整(见图1 )，而经过预处理后的玉米秸秆结构明显被破坏(见图2)，表面出现很多碎片，结构更为松散，孔隙增多，表面附着的菌落清晰可见。电镜分析结果说明本研究构建的好氧复合菌系分泌的各种纤维素酶发挥了协同作用，破坏了木质素对纤维素和半纤维的包裹作用，对木质纤维素进行了有效降解，有利于后续的水解和发酵[9]。

图1 复合菌系AMC预处理前玉米秸秆扫描电镜图像(× 500倍)

图2 复合菌系AMC预处理后玉米秸秆扫描电镜图像(× 500倍)

2.4 秸秆沼气发酵效率分析

经复合菌系处理和未经处理的玉米秸秆厌氧发酵过程中日产沼气量对比分析结果如图3所示。三组试验在发酵第1天均开始产气，其中复合菌系预处理组(AMC)与对照组(Ctrl)变化趋势相似，发酵初期日产气量几乎呈线性上升，在发酵第4天就达到产气高峰，之后又逐渐下降，波动幅度较大；复合菌系强化处理组(ANMC)日产气量变化则异于其他两组，在整个发酵过程中波动幅度较小，且维持在一个相对较高水平，但产气的最高峰值却低于其他两组。相应的甲烷含量变化如图4所示。在厌氧发酵过程中，AMC和Ctrl的甲烷含量变化趋势仍相似，从发酵初期逐渐上升至第4天达到50%以上，之后趋于稳定；而ANMC的甲烷含量在发酵初期明显低于AMC和Ctrl，之后逐渐上升，最高可达61.4%，超过AMC和Ctrl的最高值，之后略有下降，最终稳定于54%左右。日产沼气量和甲烷含量的结果表明，本研究人工驯化的厌氧复合菌系ANMC强化处理有利于缓解产气波动，提高甲烷含量；而好氧复合菌液处理效果则不明显。

生物甲烷产量是评价生物质能源转化率与沼气发酵效率的关键指标[24]。三组试验的累积甲烷产量结果如图5所示。总体上，两组复合菌系处理均能提高玉米秸秆厌氧发酵过程中累积甲烷产量。在经历40 d的厌氧发酵后，复合菌系强化处理组ANMC和复合菌系预处理组AMC的累积甲烷产量分别为242.56 mL·g-1Vs和233.09 mL·g-1Vs，相比对照依次提高了11.23%和6.89%，前者优于后者。究其原因，可能是由于AMC在对秸秆进行预处理的过程中虽然能有效促进木质纤维素的降解，将其转化为可降解糖类物质，但自身也会消耗一部分糖维持其生长需要，导致用于后续厌氧发酵的糖类物质减少，进而抵消了其对产气效率的提升作用。而ANMC是以梭菌属(Clostridumsp.)为主要类群，这些梭菌可以促进水解，有利于纤维素的降解，提高产气效率[33]。

图3 玉米秸秆厌氧发酵日产气量变化

图4 玉米秸秆厌氧发酵过程中甲烷含量变化

图5 厌氧发酵过程中累积甲烷产量变化

图6 厌氧发酵过程中挥发酸含量变化

VFA 浓度是评价水解酸化和产甲烷平衡的重要指标[34]。3组试验的总挥发酸(乙酸、丙酸、丁酸的总和)含量的变化如图6所示，在发酵前16 d，ANMC的挥发酸含量显著高于AMC和Ctrl，第6 天达到峰值2169.4 mg·L-1，这是因为厌氧复合菌系中的梭菌在代谢过程中会产生短链挥发性物质(如乙酸、丁酸等)。研究表明，TVFA 浓度小于4125 mg·L-1时对厌氧发酵的影响较小[35]。而乙酸、丁酸等短链挥发酸的产生对后续产甲烷过程是有益的，这也正是ANMC虽然挥发酸含量比其他两组高，但产气效率却没有受到抑制的原因。

综合上述产气效率指标分析结果，虽然本研究所构建的好氧和厌氧复合菌系均对玉米秸秆沼气发酵效率具有提升作用，但效果相比已有的相关研究报道[13,37]尚不理想。例如，袁旭峰等采用复合菌系MC1处理玉米秸秆4 d后，可以获得最大的秸秆总沼气产量和总甲烷产量，相比对照分别提高了33.0%和58.1%[13]。Zhong等利用构建的复合菌系处理玉米秸秆15 d，其总沼气产量、甲烷产量分别提升了33.1%、75.6%[37]。根据Zhang等人的研究，发现使用醋酸杆菌的生物强化可以提高纤维素和半纤维素的去除率，并在整个玉米秸秆的厌氧消化过程中将甲烷产量提高19%～23%[38]。然而，无论是否使用预处理或生物强化，本研究中的总沼气产量和甲烷产量仅增加了13.02%和11.23%。一方面可能是由于本研究中复合菌系预处理秸秆的时间较短，仅3 d，低于大多数的研究报道[4,13,37]，纤维素未能得到高效降解；另一方面发酵初期未对发酵原料的各项参数(如pH值、碳氮比等)进行优化，不利于厌氧发酵的高效运行；同时也反映出此次构建的复合菌系对秸秆沼气发酵效率提升效果有限，尚需进一步优化。但本文所得有关厌氧复合菌系提升秸秆沼气发酵效率的结果及其与生物强化处理提升效果的比较分析将为下一步深入开展提升秸秆沼气发酵的微生物学机理研究提供理论参考。