石油烃降解菌株的复配及其降解特性研究

高鹏飞,刘 虹，丛唯一，曾繁城，杜小彦，温 钢，付 净

(1.吉林化工学院资源与环境工程学院，吉林 吉林 132022；2.吉林省环境科学研究院，吉林 长春130012；3.吉林化工学院生物与食品工程学院，吉林 吉林 132022)

石油污染是最常见的环境污染问题之一，石油是碳氢化合物和非碳氢化合物组成的复杂混合物，包括烷烃、环烷烃和芳香烃等多种物质[1]，其中苯、萘、蒽及它们的衍生物等均为具有致癌、致畸和致突变特性的潜在化学物质[2]。石油污染物一旦进入环境，将破坏土壤和地下水的物理化学性质及使用功能，且环境中石油污染物的有毒组分经食物链富集，会对人类健康构成威胁[3-5]。石油污染环境的修复技术通常有物理、化学和微生物技术。其中，微生物技术是一种高效、廉价、多功能的修复技术，其关键因素取决于土著微生物种群或接种的外源微生物菌群的降解能力[6-7]。通常，单一菌株很难将石油烃类物质完全降解，且其适应环境的能力较差。混合微生物群落通常具有更强大的生物降解潜力，因为多种生物的代谢特征不同，从而不同的菌株拥有不同的降解能力，如吸附能力、乳化能力等,且不同菌株间可能具备协同降解能力，所以将多种微生物复配、构成混合菌群，用于石油污染的微生物修复，将更有利于污染区域中石油烃的降解[8]。

关于石油烃微生物降解及微生物修复已有大量的研究，主要集中于石油烃降解菌株的分离、筛选、鉴定及其降解特性和机制等方面[9-10]。在石油烃降解菌株的复配方面，国内外已有研究报道了将不同种菌株混合用于油泥及石油污染土壤的修复，去除其中的总石油烃及多环芳烃，例如Kasakova等[11]将恶臭假单胞菌和红球菌混合，用于油泥中多环芳烃等物质的降解，35 d对多环芳烃的降解率达到76%；Dhote等[12]将芽孢杆菌属和假单胞菌共培养，用于降解油泥中的总石油烃，其降解率达到75%；Pacwa-Pociniczak等[13]采用枯草芽孢杆菌和假单胞菌共同修复石油污染土壤，与单菌株相比，两种菌株联合使用对总石油烃的去除率提高了3倍；Asadirad等[14]将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌混合用于石油烃的降解，10 d对石油烃的降解率达77.5%。上述研究主要是将石油烃降解菌混合，研究混合菌株对石油烃或某种组分的降解效果，而未研究菌株间的复配比例及其协同降解作用，且采用的菌株主要有恶臭假单胞菌、红球菌、芽孢杆菌属、假单胞菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌等。为此，本文选取新的菌株：微嗜酸寡养单胞菌YH、类产碱假单胞菌TM和红球菌K1，将3种菌株以不同的比例进行复配，且对其间的协同降解作用进行分析，研究3种单菌株及其复配菌株对石油烃的降解效果，以为石油烃污染环境的微生物修复提供基础数据和理论支持。

1 试验材料与仪器

1.1 主要试验试剂

LB液体培养基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.2。

无机盐液体培养基：(NH4)2SO42 000 mg/L，K2HPO41 550 mg/L，NaH2PO4850 mg/L，MgCl2·6H2O 100 mg/L，EDTA 10 mg/L，FeSO4·7H2O 5.0 mg/L，ZnSO4·7H2O 2.0 mg/L，MnCl2·2H2O 1.0 mg/L，CaCl2·2H2O 1.0 mg/L，CoCl2·6H2O 0.4 mg/L，NaMoO4·2H2O 0.2 mg/L，CuSO4·5H2O 0.2 mg/L。

磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L，pH值7.0)：39 mL 0.2 mol/L NaH2PO4·2H2O 溶液与61 mL 0.2 mol/L Na2HPO4·12H2O 溶液混匀即得。

原油培养基：100 mL无机盐液体培养基中加入1 mL柴油(0#柴油，中国石化)，浓度为7.7 g/L。

富集培养基：无机盐液体培养基中加入5 g/L的葡萄糖，1 g/L的酵母膏，pH值7.0。

1.2 试验菌株

菌株来源：试验所用菌株从松原油田石油污染土壤样品中筛选、分离而得。筛选、分离条件为：采集松原油田石油污染区不同地点土壤样品进行混合，取土壤混合样品10 g，用无菌水90 mL悬浮，磁力搅拌子高速搅拌10 min，再用8层纱布过滤掉杂物碎泥，静止1 h。

首先取10 mL 悬浮液接入 100 mL富集培养基中，30℃、120 r/min 摇瓶培养10 d，由于采集的土壤样品受到石油烃污染，其石油烃含量为10 mg/kg，所以不需要另外添加石油烃；然后取10 mL上述培养液接入100 mL原油培养基中，30℃、130 r/min摇瓶培养，待观察到以上培养基中有混浊时，培养完毕，摇匀，再取培养液10 mL转接至新的驯化培养基中摇瓶培养，反复转接12次进行培养，驯化时间共计3个月；最后将驯化后的菌株悬液涂布于无机盐固体平板上，以柴油为碳源，在30℃下培养3 d后，将长出的单菌株落接种至普通固体平板中进行划线分离数次，30℃下培养，直至分至纯菌株，接种斜面培养基保藏。分离、筛选出的3种优势降解菌株，选择同源性大于98%的基因序列，经16S rDNA鉴定，3种菌株分别为：微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonasacidaminiphila) YH、类产碱假单胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)TM和红球菌(Rhodococcussp.)K1，冷藏保存。

1.3 主要仪器设备

试验所用仪器设备为：LD4-2A 医用离心机；气相色谱仪(岛津GC2014)；手提式压力蒸汽灭菌器；SP-DJ系列垂直净化工作台HZQ-QX 全温振荡器；JMS-6700F 场发射扫描仪；DHG-9320A鼓风干燥箱；DPN-9082电热恒温培养箱。

2 试验方法

2.1 菌落、菌体形态观察

将3种菌株分别接种于LB液体培养基后130 r/min、30℃下振荡培养24 h作为菌株悬液，分别将各菌株菌悬液稀释至10-8后取50 μL涂布于LB固体平板，电热恒温培养箱中培养48 h，观察菌落大小及其形态。

将3种菌株于LB液体培养基中培养至对数期，取40 mL于离心管中以6 000 r/min离心5 min，沉淀用磷酸盐缓冲液清洗2次后，将菌体悬浮于磷酸盐缓冲液中。各菌株采用JMS-6700F场发射扫描仪进行电子显微镜扫描成像，观察菌株大小及其形态。

2.2 菌株的复配及其对石油烃的降解效果测定

石油烃降解菌株的复配试验:将3种单菌株和两两组合以及3种菌株混合共组建了7个处理组，然后按照 1∶1的比例将菌悬液混合接种到含有2 000 mg/L 0#柴油的 100 mL培养基中，其中不加菌株作为空白对照，130 r/min、30℃下振荡培养6 d后每隔1 d取7个不同菌株样品和空白样测定总石油烃(TPH)的残留量，并计算总石油烃的降解率。试验设2个平行样。总石油烃降解率的计算公式如下：

(1)

式中：η为总石油烃的降解率(%)；C0为空白对照的石油烃质量浓度(mg/L);C1为降解后的石油烃质量浓度(mg/L)。

通过对比单菌株与混合菌株对石油烃的降解率的大小可以得出菌株间的协同与拮抗作用，再分别将3种菌株以不同的比例(YH∶TM∶K1)0.5∶1∶1.5、0.5∶1.5∶1、1.5∶0.5∶1、1.5∶1∶0.5、1∶0.5∶1.5、1∶1.5∶0.5进行复配，考察复配菌株对石油烃的降解效果。

2.3 复配菌株对石油烃的降解动力学研究

将最佳复配菌株接种到不同石油烃浓度(400 mg/L、600 mg/L、800 mg/L、1 000 mg/L、2 000 mg/L)的菌悬液中，考察复配菌株对不同初始浓度石油烃降解效果的影响，并根据复配菌株对不同初始浓度石油烃的降解曲线，研究其降解动力学。

2.4 总石油烃(TPH)的测试分析方法

石油烃的前处理提取方法：取培养液样品50 mL，加入10 mL正己烷进行液液萃取(萃取1次，不浓缩，回收率大于98%)。萃取后的有机相经无水硫酸钠干燥后，采用配备氢火焰离子化检测器的气相色谱仪(GC-FID)测定总石油烃(TPH)的残留量。

色谱条件：进样口温度为280.0 ℃，载气为氮气，压力为59.5 kPa，总流量为37.7 mL/min；分流比为20.0；采用Rtx-1色谱柱，30.0 m×0.25 μm×0.32 mm，柱流量为1.65 mL/min，初始温度80.0℃下平衡3.0 min，按8℃/min升温速率升温至100℃，再按10℃/min升温速率升温至200 ℃，最后按15℃/min升温速率升温至280 ℃平衡15 min，总程序为35.85 min；柱箱最大温度为330 ℃；FID检测器温度为290.0 ℃；进样体积为1.0 μL。

总石油烃(TPH)的定量分析：选取0#柴油作为标准油，用正己烷分别制备2 000 mg/L、1 000 mg/L、500 mg/L、250 mg/L、125 mg/L的溶液，并绘制其工作曲线，以色谱图中总峰面积(y)对石油烃浓度(x)进行线性回归，作标准工作曲线，两者之间存在良好的线性关系，相关系数R2=0.998 6。本方法检测限为10-6g/L。

3 结果与讨论

3.1 菌落、菌体形态特征

3种石油烃降解菌株的菌落形态特征，见表1。

表1 3种石油烃降解菌株的菌落形态特征Table 1 Morphological characteristics of three petroleum hydrocarbon degradation strains

经电子显微镜扫描，3种石油烃降解菌株YH、TM、K1的形态，见图1。

图1 3种石油烃降解菌株YH、TM、K1形态的电子 显微镜扫描图Fig.1 Electron microscopy scan of three petroleum hydrocarbon degradation strains(YH,TM,K1)

由图1可见：菌株K1为球菌，菌体大小约为0.3 μm；菌株YH、TM为杆菌，菌体大小约为0.7 μm×1 μm。

3.2 复配菌株对石油烃的降解效果

将3种菌株中任意2种菌株和3种菌株分别进行等比复配，以确定降解过程中菌株间的相互作用，即通过菌株对石油烃降解率的大小可以确定菌株间的相互作用是协同还是拮抗，若协同则菌株混合后对石油烃的降解率会高于单个菌株对石油烃的降解率，拮抗则反之。通过研究菌株间的相互作用可以得出对石油烃降解效果更好的复配菌株，3种菌株中单菌株、任意2种菌株及3种菌株等比复配对石油烃的降解效果，详见表2。

表2 3种菌株复配试验及其对石油烃的降解效果Table 2 Three strains compounding experiments and their degradation effects on petroleum hydrocarbons

通过分析表2可知：任意2种菌株(1∶1)混合后对石油烃的降解率分别为84.5%、85.4%、86.2%，均高于单个菌株的降解率81.2%、79.8%、82.1%；3种菌株(1∶1∶1)混合后对石油烃的降解率为90.7%，均高于任意2种菌株(1∶1)混合后对石油烃的降解率，表明3种菌株的混合对石油烃污染环境具有更强的降解能力。

由于石油烃是一种复杂的混合物，含有多种烃类(正烷烃、支链烷烃、芳烃、脂环烃等)，一种微生物通常只对特定的石油成分具有较强的降解能力[15]，因此3种菌株复配对石油烃的降解效果明显；同时，这表明微嗜酸寡养单胞菌S.acidaminiphilaYH、类产碱假单胞菌P.pseudoalcaligenesTM和红球菌Rhodococcussp.K1 3种菌株因相互适应而在它们之间形成了一种协同降解石油烃的机制，因此在混合后表现出更佳的降解效果[16]。相关文献研究表明：红球菌在单一组分十二烷、十八烷、苯、甲苯、二甲苯和萘的培养基中生长良好，其中红平红球菌和庆笙红球菌还能在芘的培养基中生长[17]；假单胞菌属对正十四、正十五及正十六烷烃的降解率均达80%以上，且对正十六烷的降解率高达95.9%，对、芘、蒽和菲的降解效率分别可达86.0%、80.2%、91.4%和94.5%[18]。而关于微嗜酸寡养单胞菌降解石油烃以及以上3种菌株的复配菌株对石油烃的降解研究鲜有报道，仅有对石油烃降解菌株间协同降解的相关研究，如Patowary等[19]从印度的石油污染土壤中分离出多种石油烃降解菌株，并将这些降解菌株联合使用，用于原油污染土壤的微生物修复，经过5周的降解试验，对总石油烃的降解率高达84.15%，清除了大部分石油烃。

微生物菌株的复配比例是提高石油烃降解效果的关键所在，只有调整到最佳配置比例，才能获得复合微生物菌株对石油烃的最佳降解效果，3种菌株以不同的比例进行复配对石油烃的降解效果，见图2。

图2 3种菌株不同的复配比例对石油烃的降解效果Fig.2 Degradation effect of different proportions of three strains on petroleum hydrocarbons

由图2可见，3种菌株的复配比例(YH∶TM∶K1)为1∶0.5∶1.5时对石油烃的降解效果最好，其降解率高达94.3%。这可能是因为这3种菌株在该复配比例时能够更好地相互利用营养源，单菌株产生的胞外酶和酶解基质的产物会迅速在环境中稀释，不能为种群所利用，而多种菌株复配，种群间的微生物可以利用其他微生物产生的基质，促进彼此生长，从而进一步提高了石油烃的降解率[20]。

3.3 复配菌株对石油烃的降解动力学研究

石油烃浓度过大，将会对许多石油烃降解菌株产生抑制作用，甚至导致大量菌体死亡[21]；石油烃浓度过低，则不能为菌株提供充足的营养物质，使菌株生长受到限制。本文考察了当石油烃初始浓度分别为2 000 mg/L、1 000 mg/L、800 mg/L、600 mg/L、400 mg/L时复配菌株对石油烃的降解效果。复配菌株对不同初始浓度石油烃的降解曲线见图3，通过对图3的降解曲线进行拟合，得到复配菌株对不同初始浓度石油烃的降解动力学拟合方程和降解半衰期(t1/2)，见表3。

图3 复配菌株对不同初始浓度石油烃的降解曲线Fig.3 Degradation curves of petroleum hydrocarbons with different initial concentrations by compound strains表3 复配菌株对不同初始浓度石油烃的降解动力学 拟合方程和降解半衰期Table 3 Kinetic fitting equations and degradation hafe life for the degradation of petroleum hydrocarbons with different initial concentrations by compound strains

石油烃的初始浓度(mg·L-1)降解动力学拟合方程反应级数t1/2/dR22 000y=-309.6x+2 045.003.40.9311 000lny=-0.447x+7.42712.70.994800lny=-0.434x+6.94912.20.976600lny=-0.411x+6.62312.20.982400lny=-0.391x+6.24612.40.991

由图3和表3可见，复配菌株对不同初始浓度石油烃的降解效果有所差异，但降解率都高于90%，证明复配菌株对石油烃的降解效果良好；当石油烃的初始浓度为2 000 g/L时，复配菌株的降解动力学曲线与零级动力学过程的拟合效果良好，这表明石油烃残留浓度随着时间的增加呈线性降低；当石油烃的初始浓度分别为1 000 mg/L、800 mg/L、600 mg/L、400 mg/L时，复配菌株的降解动力学曲线与一级动力学方程的拟合效果良好，其降解半衰期t1/2为2.2～2.7 d。

4 结 论

(1) 本试验选取新的菌株：微嗜酸寡养单胞菌YH、类产碱假单胞菌TM和红球菌K1，对3种菌株以不同的比例进行复配，考察了单菌株与复配菌株对石油烃的降解效果。结果表明：复配后的菌株对石油烃的降解效果均优于单菌株，且3种菌株对石油烃具有协同降解能力。

(2) 通过对3种菌株不同的复配比例(YH∶TM∶K1)0.5∶1∶1.5、0.5∶1.5∶1、1.5∶0.5∶1、1.5∶1∶0.5、1∶0.5∶1.5、1∶1.5∶0.5时对石油烃的降解效果进行研究，结果表明：当复配菌株的复配比例(YH∶TM∶K1)为1∶0.5∶1.5时对石油烃的降解效果最好；初始浓度为2 000 mg/L的石油烃，加入复配菌株，在130 r/min、30℃下振荡培养6 d后，总石油烃的降解率为94.3%。

(3) 复配菌株对石油烃的降解动力学研究表明：当石油烃的初始浓度为2 000 g/L时，复配菌株降解动力学曲线与零级动力学方程的拟合效果良好；当石油烃的初始浓度分别为1 000 mg/L、800 mg/L、600 mg/L、400 mg/L时,复配菌株降解动力学曲线与一级动力学方程的拟合效果良好，其降解半衰期为2.2～2.7 d。