超高效液相色谱法比较鲜川芎和川芎药材中6种成分含量

陈 冉，尹丹丹，杨 沫，王运来，尹登科，许 钒

(1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012;2.中药复方安徽省重点实验室，安徽 合肥 230012)

川芎为伞形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根状茎，挥发油类是构成川芎气味雄烈的主要物质。药理研究表明，川芎的药效物质基础为内酯类成分如藁本内酯、洋川芎内酯H、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A[1-3]，芳香酸类如阿魏酸[4-5]及生物碱如川芎嗪[6-7]。川芎嗪、阿魏酸及洋川芎内酯类化合物在抗氧化损伤、抗炎镇痛、抗凝及抗血小板聚集、神经保护等方面具有显著作用[8-12]。

川芎所含成分不稳定，易受到温度及光照影响发生成分损失；室温贮藏及自然光照条件下即可发生多种途径的降解行为[13-16]。因此，不同的温度及光照条件直接影响川芎中各成分的转化及含量。

鲜川芎在产地经火炕烘干后撞去泥沙和须根即为川芎药材，烘干温度小于70 ℃。笔者推测，受烘干过程中温度的影响，川芎药材与鲜川芎的化学成分间存在差异。但目前较多的研究关注川芎药材贮藏期间的成分变化，本课题旨在对鲜川芎与川芎药材中的6种活性成分(川芎嗪、阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、洋川芎内酯A)进行测定，初步比较二者化学成分差异，为川芎的产地加工提供实验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Waters Acquity UPLC-PAD色谱系统(包括二元泵、自动进样器、柱温箱、PAD检测器、Empower 2工作站)：美国Agilent公司；ML303E千分之一电子天平：梅特勒-托利多上海有限公司；KQ-600DB型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；DFY-300多功能高速中药粉碎机：温州鼎历医疗器械有限公司。

1.2 试剂 乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)：美国Fisher公司；0.22 μm有机相针式滤器：江苏津腾公司；超纯水：自制；盐酸川芎嗪(批号110817-201608，纯度≥98%)、阿魏酸(批号110773-201614，纯度≥98%)、藁本内酯(批号111737-201608，纯度≥98%)：均购买于中国食品药品检定研究院；洋川芎内酯H(批号 P12J8F39794，纯度≥98%)、洋川芎内酯I(批号 P12J8F39795，纯度≥98%)、洋川芎内酯A(批号 P12J8F39796，纯度≥98%)：购于上海源叶生物科技有限公司。

1.3 药材 新鲜的川芎根状茎于2017年5月收获期采集自四川彭州市敖平镇凤鹤村，川芎药材(批号：161219，产地四川)购买自安徽普仁中药饮片有限公司，经安徽中医药大学金传山教授鉴定为伞形科川芎LigusticumchuanxiongHort.的新鲜及干燥根状茎，见图1。

图1鲜川芎与川芎药材切片(A.鲜川芎；B.川芎药材)

2 方法

2.1 样品制备

2.1.1 供试品溶液制备 川芎自产地采收后，洗净泥沙，晾干水分后，作为鲜川芎。将同一批次鲜川芎于60 ℃烘箱中烘烤6 h作为川芎药材。新鲜川芎含水量较高，为降低水分对成分测定的影响，在采用超高效液相串联光电二极管阵列检测器进行含量测定前，根据2015年版《中华人民共和国药典》一部规定[17]，采用甲苯法测定鲜川芎及川芎药材含水量分别为62.73%、8.73%，鲜川芎与川芎药材的质量比为7.18。将一定质量的鲜川芎和川芎药材粉碎至过三号筛，分别取5 g，采用50 mL的75%甲醇以超声功率80 W超声提取(室温25 ℃)30 min，室温放置6 h后分别取上清，过0.22 μm有机滤膜，得滤液备用。

2.1.2 对照品溶液制备 取各标准品一定量，配制盐酸川芎嗪、阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、洋川芎内酯A、藁本内酯浓度分别为65、50、30、12、400、682 μg/mL的混合标准溶液母液。

2.2 色谱条件 色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm)，配备有Acquity UPLC柱在线过滤系统。采用梯度洗脱，流动相为乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)。梯度洗脱过程：0～0.5 min，5% A；0.5～8 min，5%～45% A；8～10 min，45% A；10～11 min，45%～48% A；11～16 min，48%～50% A；16～18.5 min，50%～60% A；18.5～20 min，60%～75% A；20～22 min，75%～90% A；22～23 min，90%～5% A；23～25 min，5% A。检测波长295 nm，流速0.2 mL/min，进样体积2 μL。

2.3 专属性考察 取标准品溶液、川芎药材及鲜川芎样品溶液，进样容积2 μL，按照“2.2”项下色谱条件进样分析，所得色谱图见图2、图3。

注：A.空白对照品；B.鲜川芎；C.川芎药材；D.混合标准品；1.盐酸川芎嗪；2.阿魏酸；3.洋川芎内酯I；4.洋川芎内酯H；5.洋川芎内酯A；6.藁本内酯

图2鲜川芎与川芎药材的UPLC图

注：A.混合标准品；B鲜川芎；C.川芎药材；D.空白对照品；1.盐酸川芎嗪；2.阿魏酸；3.洋川芎内酯I；4.洋川芎内酯H；5.洋川芎内酯A；6.藁本内酯

图3鲜川芎与川芎药材的UPLC色谱图

2.4 线性范围考察 精密移取混合标准溶液母液0.125、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释，定容至刻度，摇匀，配成混合对照品溶液。按“2.2”项下色谱条件进样分析，以质量浓度(ρ)为横坐标、峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线。见表1。

表1 6种成分的回归方程及线性范围

2.5 精密度试验 按照“2.2”项下色谱条件，将同一混合标准品溶液重复进样6次，记录色谱图，计算得到川芎嗪、阿魏酸、洋川芎内酯H、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、藁本内酯的峰面积的RSD分别为0.13%、0.89%、1.52%、1.68%、0.89%、0.94%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 将同一批次的供试品溶液室温下放置0、2、4、8、12、16、24 h后分别进样分析，计算得到各成分峰面积的RSD，分别为阿魏酸0.19%、洋川芎内酯H 0.92%、洋川芎内酯I 0.14%、洋川芎内酯A 0.14%、藁本内酯0.16%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验 取同批川芎药材6份进样，按照供试品溶液制备方法制备后进样分析，对重复性试验进行考察，分别计算得到各成分峰面积的RSD，分别为阿魏酸0.34%、洋川芎内酯I 0.67%、洋川芎内酯H 1.32%、洋川芎内酯A 0.46%、藁本内酯0.27%，表明方法重复性较好。

2.8 加样回收率试验 精密称定0.25 g鲜川芎及川芎药材6份，加入各对照品溶液，按照“2.1”项下样品制备方法制备供试品溶液，按照“2.2”项下色谱条件，进样分析，计算6种成分的回收率和RSD，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果

注：空白单元格表示该项下没有检测到相应化合物

2.9 含量测定 按“2.1”项下条件制备样品溶液，按“2.2”项下条件测定。根据川芎药材与鲜川芎质量比折算，川芎药材与鲜川芎中6种成分质量分数见表3。通过与6种物质的标准品对比，鲜川芎中检测出3种成分别是阿魏酸、藁本内酯、洋川芎内酯A；川芎药材中，除川芎嗪外，其余5种成分均被检测出。本研究未在川芎药材及鲜川芎检测到川芎嗪，川芎中川芎嗪含量较低。鲜川芎中未检测到洋川芎内酯H、洋川芎内酯I。

表3 鲜川芎及川芎药材含量测定结果

注：空白单元格表示该项下没有检测到相应化合物；w(川芎药材)=(m/M)×100%，式中m代表川芎药材中检测出该化合物的质量，M代表川芎药材的质量；w(鲜川芎)=(m/7.18M)×100%，式中m代表鲜川芎中检测出该化合物的质量，M代表鲜川芎的质量；平均质量分数分别为鲜川芎、川芎药材6个批次的平均值

3 讨论

3.1 提取方式及时间考察 川芎药材及鲜川芎中富含挥发性成分，因此在提取时选取了超声提取。本研究中使用的鲜川芎未经加工处理，含水量较大，考虑到含水量对提取率的影响，对提取时间进行了考察，分为超声提取30 min、超声提取30 min后室温放置2 h、超声提取30 min后室温放置6 h、超声提取30 min后室温放置12 h，结果表明超声提取30 min后室温放置6 h为最佳提取方式。

3.2 检测波长的选择 结合川芎嗪、阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、洋川芎内酯A、藁本内酯的光谱性质，选择了254、270、280、295、320 nm作为考察检测波长，实验结果表明，295 nm下6种活性成分响应效果较佳，因此选择295 nm作为最佳检测波长。

3.3 鲜川芎与川芎药材的成分转化 本实验将同一批鲜川芎、川芎药材纳入研究，UPLC检测结果发现鲜川芎与川芎药材间成分存在较大的差异。据报道，藁本内酯及洋川芎内酯A是川芎药材中含量较高的两种活性成分[19]。内酯类成分易发生结构改变和转化，在产地加工及储藏过程中的加热、暴晒等程序会增加川芎的成分转化。藁本内酯在自然光照下可降解为洋川芎内酯H和洋川芎内酯I[13]；洋川芎内酯I在阳光照射下可形成二聚体[14]。在川芎药材的提取或贮藏过程中，阿魏酸松柏酯易水解为阿魏酸，增加川芎中游离阿魏酸的含量[15]。贮藏两年的川芎药材，阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H的含量平均增加46.9%，阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯A、藁本内酯的含量平均减少48.3%[16]。鲜川芎的产地加工有两种方式，一为阳光露晒，一为炕床烘干。受加工过程中的光照、温度影响，鲜川芎中的成分发生转化，藁本内酯、洋川芎内酯A含量降低，洋川芎内酯I和洋川芎内酯H含量增加。实验结果表明，鲜川芎与川芎药材成分存在差异。

洋川芎内酯类化合物是川芎的主要活性成分及代谢成分。藁本内酯在大鼠体内的降解产物为洋川芎内酯H和洋川芎内酯I[20]，但人体内的主要代谢产物为洋川芎内酯I[21]。研究表明，洋川芎内酯I可快速入血入脑[22]，这为川芎的临床治疗疾病提供了直接的物质基础。

本研究通过UPLC测定鲜川芎和川芎药材中6种活性成分的含量，发现鲜川芎、川芎药材中存在成分差异。鲜川芎及川芎药材中均未检测到川芎嗪；鲜川芎中内酯类化合物在产地加工中发生转化，藁本内酯含量降低，洋川芎内酯I、洋川芎内酯H含量增加。