苍耳子水提取物对变应性鼻炎豚鼠鼻黏膜病变和血清炎症细胞因子的影响

2019-12-05孙小草章秀梅刘丛彬俞年军谢冬梅

安徽中医药大学学报 2019年6期

孙小草，张强，章秀梅，刘丛彬，俞年军,2，谢冬梅,2

(1.安徽中医药大学药学院，安徽合肥 230012；2.安徽省中医药科学院中药资源保护与开发研究所，安徽合肥 230012)

变应性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是机体接触变应原后由免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)介导的鼻黏膜非感染性慢性炎症性疾病，其典型症状为阵发性喷嚏、鼻痒和鼻塞、流涕等[1]。AR的发病机制复杂，现代研究认为其主要是免疫调节细胞Th1与Th2比例失衡引起的变应性炎症疾病。当Th1细胞释放的干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)等细胞因子不足时，Th2细胞会出现亢进现象，产生大量的白细胞介素-4(interleukin-4，IL-4)等细胞因子，从而引起IgE过量，引起AR[2-3]。目前临床治疗AR的药物种类有糖皮质激素类、抗组胺类、抗白三烯类等，其中抗组胺类药物具有良好的安全性、较少的不良反应等优点而成为临床常用药，如氯雷他定、依巴斯汀[3-5]。

苍耳子(Xanthii Fructus)为菊科植物苍耳(XanthiumsibiricumPatr.)的干燥成熟带总苞的果实，具有散风寒、通鼻窍、祛风湿的功效[6]。在治疗鼻炎、鼻窦炎及AR的30种临床常用中药方剂中，含有苍耳子的有23种，且均作为君药或臣药使用，如以苍耳子为君药的苍耳子散对小儿AR具有治疗作用[7]。由苍耳子挥发油制备的苍耳油滴鼻剂有明显的降低AR豚鼠血清IgE水平，修复鼻黏膜结构的作用[8]。此外，研究发现苍耳子中含有的咖啡奎宁酸类化合物可能为抗炎镇痛的主要活性成分之一，其水提取物有抗过敏活性[9]。本实验通过复制AR豚鼠模型，观察中药苍耳子水提取物对AR豚鼠鼻部行为学症状、鼻黏膜组织病理变化以及血清炎症细胞因子水平的影响，为苍耳子治疗AR提供实验依据。

1 材料

1.1 动物及分组 SPF级豚鼠70只，体质量200～240 g，购于南京市江宁区青龙动物繁殖场[生产许可证号：SCXK(苏)2012-0008]。将豚鼠随机分为正常组，模型组，氯雷他定组(2 mg/kg)，玉屏风散组(3 g/kg)，苍耳子水提取物高剂量(4 g/kg，相当于成人临床用量的6倍)、中剂量(2 g/kg)、低剂量(1 g/kg)组，每组10只，雌雄各半。

1.2 药物与试剂中药苍耳子于2017年10月采自北京市朝阳区长乡店，经安徽中医药大学方成武教授鉴定为菊科植物苍耳(XanthiumsibiricumPatr.)成熟带总苞的果实。采用水提取法[10]制备，滤液加热浓缩至浓度为0.4 g/mL，备用；将氯雷他定片溶于蒸馏水，制成2 mg/mL的溶液；将玉屏风散溶于蒸馏水，制成3 g/mL的溶液。

卵蛋白(ovalbumin，OVA；批号 926A034)：北京索莱宝科技有限公司；氢氧化铝(批号 21645-51-2)：上海麦克林生化科技有限公司；氯雷他定(批号 180225073)：西安杨森制药有限公司；玉屏风颗粒(批号 ZFB1704)：云南白药集团股份有限公司；IgE、IL-4、IFN-γ ELISA检测试剂盒(批号分别为20180516、20180522、201800426)：北京安迪华泰科技有限公司。

1.3 仪器 MSS全波长酶标仪(型号 RT-6000)：深圳雷杜公司；高速冷冻离心机(型号 JW3021HR)：安徽嘉文仪器公司；涡旋混合器(型号 GL-88B)：其林贝尔仪器制造公司；TS-12生物组织自动脱水机；BM-IX生物组织石蜡包埋机；LEICA 2016轮转式切片机；Olympus BX51显微镜；JD-80ID形态学图形分析系统。

2 方法

2.1 模型复制基础致敏阶段采用腹腔注射、局部刺激阶段采用滴鼻的方法复制AR豚鼠模型[11]。①基础致敏阶段：OVA和氢氧化铝以1∶100容积比溶于生理盐水中，使OVA的浓度为0.3%，作为致敏剂。每只豚鼠腹腔注射1 mL，隔日1次，共致敏7次，用时14 d。②局部刺激阶段：从第22—31天，对每只豚鼠采用滴鼻法，以5% OVA生理盐水溶液每侧5 μL滴于豚鼠双侧鼻孔，隔日1次。以上步骤正常组均以等容积生理盐水代替。

每日滴鼻后，依据鼻痒、流涕、呼吸轻重程度及喷嚏次数多少为评分标准[12]。①鼻痒：轻擦鼻几次，计1分；挠鼻不止，计2分；不断挠鼻，计3分。②流涕：流至前孔，计1分；过鼻孔，计2分；流涕满面，计3分。③呼吸：呼吸急促，计1分；明显喘息，计2分；喘息致死，计3分。④喷嚏：滴鼻后30 min内1～3个，计1分；4～10个，计2分；10个以上，计3分。于第22、26、30天滴鼻后30 min内，观察各组豚鼠的过敏性症状，并将各症状积分叠加，总分大于5分者为模型复制成功。

2.2 分组及给药最后一次滴鼻后，根据鼻部行为学症状评分结果重新随机分为7组。正常组与模型组豚鼠灌胃给予等容量蒸馏水，其余各组豚鼠分别灌胃给予相应药物，连续14 d，每日1次。同时采用5% OVA生理盐水溶液隔日滴鼻，以维持过敏性症状直至实验结束。并于给药后第7、13天滴鼻后30 min观察过敏性症状并进行评分。

2.3 检测指标及方法

2.3.1 鼻部行为学症状观察模型复制期间，于局部刺激阶段观察第22、26、30天各组豚鼠的过敏性症状并进行评分。给药期间，于给药第7、13天再次激发，观察各组豚鼠的过敏性症状并记录最后一次滴鼻评分。评分标准见“2.1项”。

2.3.2 鼻黏膜组织病理变化观察末次给药1 h后，用10%水合氯醛麻醉处死豚鼠，打开鼻盖骨，暴露鼻甲及骨性鼻中隔，剥离完整鼻黏膜后放入4%甲醛固定，苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色，光学显微镜下观察、拍照、分析。

2.3.3 血清IL-4、IFN-γ及IgE水平检测末次给药1 h后，用10%水合氯醛麻醉处死。腹主动脉取血，推入离心管静置3 h后，4 ℃ 3 000 r/min离心10 min，收集血清。根据酶联免疫吸附试验试剂盒说明书操作，依次检测实验豚鼠血清中IL-4、IFN-γ、IgE水平。

3 结果

3.1 苍耳子水提取物对AR豚鼠鼻部行为学症状的影响模型复制期间，从第1次滴鼻开始，豚鼠30 min内均出现不同程度挠鼻、喷嚏症状，但无明显流涕、呼吸急促等症状；从第3次滴鼻开始，复制模型的豚鼠不仅出现挠鼻不止、喷嚏不断，还出现流涕、呼吸急促等症状；随着滴鼻次数的增加，模型豚鼠过敏性症状也越来越明显。结果说明采用OVA和氢氧化铝腹腔注射并局部刺激的豚鼠AR模型复制成功。

给药后，与模型组相比，除玉屏风散组外，其他用药组AR豚鼠鼻部行为学症状积分均有不同程度的降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。结果说明苍耳子水提取物对AR豚鼠的过敏性症状有一定影响。见表1。

3.2 各组豚鼠鼻黏膜组织形态学变化比较 HE染色结果显示，正常组豚鼠鼻黏膜上皮组织结构完整，无血管、腺体改变及炎症细胞、嗜酸性粒细胞浸润(图1A)。模型组豚鼠鼻黏膜上皮组织出现明显脱落，小血管、腺体出现明显的增生扩张，组织水肿，大量炎症细胞、嗜酸性粒细胞浸润(图1B)；氯雷他定组鼻黏膜上皮组织结构较为完整，未见明显小血管增生，少量炎症细胞浸润(图1C)；玉屏风散组鼻黏膜上皮组织轻微脱落，腺体轻微扩张，有嗜酸性粒细胞浸润(图1D)；苍耳子水提取物高剂量组鼻黏膜上皮组织较为完整，少量炎症细胞浸润(图1E)；中剂量组上皮组织基本完整，组织轻微水肿，有炎症细胞浸润(图1F)；低剂量组鼻黏膜上皮组织有轻微脱落，小血管、腺体增生扩张明显，炎症细胞、嗜酸性粒细胞浸润明显(图1G)。

表1 各组豚鼠鼻部行为学症状积分比较

注：与正常组比较，*P<0.05

注:A.正常组;B模型组;C.氯雷他定组;D.玉屏风散组;E.苍耳子水提取物高剂量组;F.苍耳子水提取物中剂量组;G.苍耳子水提取物低剂量组图1 各组豚鼠鼻黏膜组织形态学变化比较(HE染色,10×20倍)

3.3 各组豚鼠血清IgE、IL-4、IFN-γ水平比较与正常组比较，模型组豚鼠血清IgE、IL-4水平显著升高(P<0.05)，IFN-γ水平显著降低(P<0.05)；与模型组比较，各用药组豚鼠血清IgE、IL-4水平显著降低(P<0.05)，IFN-γ水平显著升高(P<0.05)；苍耳子水提取物各剂量组IgE、IL-4、IFN-γ水平多重比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，呈现明显的剂量依赖性。见表2。

4 讨论

苍耳子作为临床治疗鼻渊头痛的常用药，具有抗炎、镇痛、抗过敏、调节免疫等多种药理作用。在调节免疫功能方面，苍耳子水煎液中琥珀酸被认为可能是苍耳子调节免疫功能的活性成分之一[13]。王龙妹等[14]发现，苍耳子水煎液对细胞免疫作用明显。张芩等[15]发现，玉屏风散合苍耳子散可调节机体免疫功能。

豚鼠具有易致敏的生物学特性，并且因血清中含有大量的补体，能产生稳定的、高效价的特异性免疫球蛋白，常被选为AR的模型动物。因此，以OVA和氢氧化铝的混悬液作为致敏剂，腹腔注射和滴鼻激发AR豚鼠模型。阵发性喷嚏、鼻痒、流涕等为AR患者的典型症状，滴鼻激发可使模型动物产生相同的过敏性症状，对过敏性症状进行评分可以初步判断模型是否成功，是评价药物治疗AR疗效的主要方法[11-12]。

Th1细胞主要介导细胞免疫应答，通过释放IFN-γ、IL-2等细胞因子来抑制Th2细胞活化；Th2细胞主要介导体液免疫应答，通过产生IL-4、IL-5等细胞因子来抑制Th1细胞分化，当Th1细胞释放的IFN-γ等细胞因子不足时，Th2细胞出现亢进现象，产生大量的IL-4，从而引起IgE过量[16-17]。因此，通过检测豚鼠血清中IL-4和IFN-γ水平变化，可以评价苍耳子水提取物对Th1/Th2细胞平衡的影响，同时检测血清中IgE水平变化，可以反映AR豚鼠病理状态的严重程度。

除IL-4外，Th2细胞还可以释放其他细胞因子刺激肥大细胞释放递质，从而引起鼻黏膜上皮组织病变，鼻黏膜上皮组织由柱状纤毛细胞、柱状细胞、杯状细胞和基底细胞紧密相连于基底膜上形成上皮屏障。当接触变应原后，会出现基底膜病变，致使柱状细胞脱落、炎症细胞浸润、小血管扩张等病变[18]。因此，通过HE染色观察AR豚鼠鼻黏膜病理变化以评价苍耳子水提取物对AR豚鼠鼻黏膜组织的影响。