仙茅苷对学习无助抑郁模型小鼠海马细胞凋亡的作用及其机制研究

申丰铭，杨三娟，张峥嵘，朱国旗

(新安医学教育部重点实验室 安徽中医药大学，安徽 合肥 230038)

抑郁症是以食欲减退、睡眠模式异常、能量水平降低、注意力或身体活动降低、低价值感和内疚感等为特征的疾病[1]。2002年，世界卫生组织将抑郁症列为第四大流行疾病。除了广泛的发病率，抑郁症的特点还有高复发率、高残疾率和高病死率[2]。仙茅苷是仙茅的主要活性成分。仙茅苷可通过血脑屏障，广泛分布于大脑[3]。仙茅苷的现代药理活性主要包括抗氧化活性、心血管保护、神经保护等[4-6]。然而，尚不清楚仙茅苷是否能改善抑郁样行为及其作用机制。因此，本研究采用学习无助小鼠模型来探讨仙茅苷对其抑郁样行为的保护作用及其机制。

1 材料

1.1 动物 雄性C57BL/6小鼠，体质量20～25 g，购于安徽医科大学实验动物中心[生产许可证号：SCXK(皖)2016-0009]。将小鼠饲养在温度恒定的动物房中，光周期8:00 am—8:00 pm，自由饮水和摄食。动物进行实验前先适应饲养1周。

1.2 药物与主要试剂 仙茅苷(纯度98.94%)：BIOX科技有限公司；星形胶质细胞的标记物胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)：麻萨诸塞州沃本生物抗体公司；Alexa Fluor 593山羊抗兔IgG：加利福尼亚州卡尔斯巴德生命技术公司；脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TdT-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL)细胞凋亡检测试剂盒：上海碧云天生物技术公司；磷酸化蛋白激酶A(p-protein kinase A, p-PKA)、蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、磷酸化细胞外调节蛋白激酶(p-extracellular regulated protein kinases，p-Erk)、细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases， Erk)、突触后密度蛋白95(postsynaptic density protein 95，PSD95)抗体：Cell Signaling Technology；3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)：北京中杉金桥生物技术有限公司；辣根过氧化物酶标记抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记抗鼠IgG：北京中杉金桥生物技术有限公司；化学发光液(electrochemiluminescence，ECL)：Pierce。

2 方法

2.1 动物分组、模型复制及给药 将60只小鼠随机分为正常对照组，学习无助组，仙茅苷高剂量(40 mg/kg)、仙茅苷中剂量(8 mg/kg)、仙茅苷低剂量(1.6 mg/kg)组，每组12只。模型复制方法参照文献[7]。根据预实验结果，模型复制能够使小鼠产生抑郁样行为，表现为小鼠在悬尾和强迫游泳实验中不动时间的增加。在第1—14天，仙茅苷治疗组每日以40、8、1.6 mg/kg的剂量腹腔注射，仙茅苷溶于生理盐水(含0.1% DMSO)，正常对照组和学习无助组小鼠不进行给药。在第8—10天，学习无助组和仙茅苷给药组进行复制模型，连续3 d在同一时间内给予学习无助组和仙茅苷高、中、低剂量组小鼠不可避免的足底电击(0.70 mA，每次电击20 s，间隔随机)30次，这一过程是在条件恐惧箱中用ANY-Maze软件(Stoelting Co. verion 4.99 m)控制进行的。正常对照组小鼠在第8—10天，置于相同的环境中，但不给予足底电击。24 h进行行为学实验，经异氟烷麻醉后断头取脑组织，检测海马齿状回(dentate gyrus，DG)区细胞凋亡、GFAP表达及相关信号通路的表达变化。

2.2 悬尾实验(tail suspension test，TST) 仙茅苷治疗14 d后，用胶带将每只小鼠(距离尾部约1 cm处)悬挂在隔音箱顶部(距底部约50 cm)。各组悬尾6 min，前2 min为适应时间，记录第3—6分钟内小鼠不动时间的总和。实验结束后，迅速将小鼠从支架取下并轻放回饲养笼内。

2.3 强迫游泳实验(forced swim test，FST) 将小鼠分别置于水面高10 cm的2 L玻璃容器中，水温为(22±3)℃，游泳6 min，结束后将小鼠烘干(32 ℃)后放入笼中。用Super Maze软件记录行为。将测试的最后4 min不动时间纳入统计。

2.4 免疫荧光检测海马DG区GFAP荧光强度 小鼠用异氟烷麻醉后处死取脑。小鼠脑组织在4%多聚甲醛中固定24 h，用30%蔗糖4 ℃脱水，冰冻切片(片厚20 μm)，封闭(10%山羊血清)1 h。加入0.1 mol/L PBS(含有0.4%Triton X-100和5%山羊血清)稀释的一抗，4 ℃孵育过夜。PBS洗3次，每次15 min。洗完再加入Alexa Fluor 593山羊抗兔IgG，室温下孵育2 h。之后再用PBS洗涤3次，胞核经4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI) 染色，贴片，树脂封片。使用激光共聚焦显微镜拍摄图像。使用Image J软件将DAPI和GFAP合并得到Merge，并分析GFAP的荧光强度值。

2.5 TUNEL染色检测海马DG区细胞凋亡数 步骤按照一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书进行，在20 μm脑切片中进行TUNEL染色。染色后，使用激光共聚焦显微镜对切片成像。使用Image J 软件中的“自由手选择”功能绘制每个图像中海马体的轮廓对海马体进行分析，使用Image J 中的“粒子分析”功能对海马DG区TUNEL染色阳性细胞进行计数。

2.6 Western blot检测海马区相关蛋白的表达水平 将从每组小鼠脑中提取得到的海马组织加入RIPA(含PMSF)匀浆裂解，用于检测PKA、Erk磷酸化水平及PSD95的表达。用SDS-PAGE在120 V下电泳分离蛋白质样品，时间50 min，并在200 mA下转膜2 h，将蛋白转移到硝酸纤维素(nitrocellulose filter membrance，NC)膜上。用5%脱脂奶粉封闭NC膜，室温下2 h，然后与用一抗稀释液以1∶1 000稀释的p-PKA、PKA、p-Erk、Erk、PSD95抗体以及内参GAPDH置于摇床中，4 ℃下孵育过夜，PBST洗涤3次，之后加入二抗(1∶10 000稀释)孵育2 h，洗涤。ECL显色，曝光。使用Image J软件分析条带的光密度值。总蛋白的相对含量用其与GAPDH的比值表示。

3 结果

3.1 各组小鼠学习无助引发的抑郁样行为比较 小鼠的抑郁样行为可用TST、FST来评估。在TST中，与正常对照组比较，学习无助组小鼠不动时间显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与学习无助组比较，仙茅苷给药组小鼠不动时间显著减少，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1-Ⅰ。在FST中，与正常对照组比较，学习无助组小鼠不动时间显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与学习无助组比较，仙茅苷给药组小鼠不动时间显著减少，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1-Ⅱ。

注：Ⅰ.TST中小鼠不动时间；Ⅱ.FST中小鼠不动时间；A.正常对照组；B.学习无助组；C.仙茅苷高剂量组；D. 仙茅苷中剂量组；E. 仙茅苷低剂量组；与正常对照组比较，*P<0.05；与学习无助组比较，#P<0.05

图1各组小鼠学习无助引发的抑郁样行为比较

3.2 各组小鼠海马组织DG区细胞凋亡数比较 与正常对照组比较，学习无助组海马组织DG区细胞凋亡数显著增加(P<0.05)；与学习无助组比较，仙茅苷高剂量组海马组织DG区细胞凋亡数显著减少(P<0.05)。见图2、图3。

注：A.正常对照组；B.学习无助组；C.仙茅苷高剂量组；箭头示凋亡细胞

图2各组小鼠海马组织DG区细胞凋亡免疫荧光图(TUNEL染色，10×20倍)

注：A.正常对照组；B.学习无助组；C.仙茅苷高剂量组；与正常对照组比较，*P<0.05；与学习无助组比较，#P<0.05

3.3 各组小鼠海马DG区GFAP表达比较 与正常对照组比较，学习无助组小鼠海马DG区GFAP表达显著上调(P<0.05)；与学习无助组比较，仙茅苷高剂量组海马组织DG区GFAP表达显著下调(P<0.05)。见图4、图5。

3.4 各组小鼠海马组织中p-PKA、p-Erk、PSD95表达比较 与正常对照组比较，学习无助组小鼠海马组织中p-PKA、PSD95表达显著下调(P<0.05)，p-Erk表达差异无统计学意义(P>0.05)；与学习无助组比较，仙茅苷高剂量组小鼠海马组织中p-PKA、PSD95表达显著上调(P<0.05)，p-Erk表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图6。

4 讨论

学习无助模型是最早用于复制抑郁症的模型之一[8]，其属于抑郁症的环境应激模型。学习无助模型可以反映与抑郁症相关的重要认知变化。有充足

图4 各组小鼠海马DG区GFAP表达免疫荧光图(免疫荧光染色，10×20倍；箭头指示活化的星形胶质细胞)

注：A.正常对照组；B.学习无助组；C.仙茅苷高剂量组；与正常对照组比较，*P<0.05；与学习无助组比较，#P<0.05

的证据表明，学习无助动物表现出与人类抑郁相似的几种行为变化[9]。研究表明，仙茅苷可以改善和治疗围绝经期小鼠模型的抑郁症状[10]。在本研究中，笔者选用了学习无助小鼠模型，结果表明学习无助引起的抑郁样行为通过TST和FST得到验证，而仙茅苷治疗能改善其抑郁样行为。在仙茅苷给药组中，仙茅苷高剂量(40 mg/kg)组的抑郁样行为改善程度最为显著。因此，在后续的指标检测中选取仙茅苷高剂量组进行机制的研究。

细胞凋亡是细胞死亡的一种形式，过度或不适当的细胞凋亡与许多疾病有关，其中就包括抑郁症[11]。研究表明，持续的压力可以导致海马的兴奋性神经毒性损伤，并影响其功能[12]。许多抗抑郁药的作用可能是通过抑制神经细胞凋亡来实现的[13]。本研究结果表明，学习无助小鼠海马DG区的细胞凋亡显著增加，而给予仙茅苷能够明显抑制这一变化。此结果也提示仙茅苷可以通过抑制细胞凋亡来发挥抗抑郁的作用。

神经细胞死亡与星形胶质细胞功能密切相关。星型胶质细胞激活可能是抑郁样行为发生的重要机制。星形胶质细胞可以通过数量增加或体积增大来引起神经细胞损伤并表达更高水平的GFAP[14]。星形胶质细胞激活可以破坏神经细胞突触传递并发生在各种神经退行性疾病中[15]。本研究结果表明，学习无助小鼠中GFAP阳性表达增加，而通过给予仙茅苷处理抑制了这种表达。

PKA参与代谢、细胞生长、基因表达和细胞凋亡。在抑郁模型中，PKA在海马中的表达和活性降低，而抗抑郁药可以增加皮质和海马中的PKA活性，如三环类抗抑郁药和N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂联用可增加皮质和海马中p-PKA水平，而且应激和抑郁中突触可塑性的变化可能与PKA信号转导途径相关[16]。本研究结果表明，学习无助组中PKA磷酸化水平降低，而给予仙茅苷处理可以逆转p-PKA降低，而且学习无助组中PSD95水平降低，而给予仙茅苷治疗可以使学习无助引起的PSD95表达降低恢复正常。PKA信号通路可能与抑郁中的突触可塑性变化有关，仙茅苷作用的具体机制需要进一步的研究。

注：Ⅰ.代表性蛋白印迹条带；Ⅱ.p-PKA表达结果；Ⅲ.p-Erk表达结果；Ⅳ.PSD95表达结果；A.正常对照组；B.学习无助组；C.仙茅苷高剂量组；与正常对照组比较，*P<0.05；与学习无助组比较，#P<0.05

图6各组小鼠海马组织中p-PKA、p-Erk、PSD95表达比较

本研究证实仙茅苷可以改善模型小鼠抑郁样行为，抑制学习无助小鼠的神经细胞凋亡，并使学习无助小鼠星形胶质细胞的活化减少。这些数据表明仙茅苷可能是一种有效的抗抑郁药。仙茅是治疗抑郁的处方“二仙汤”的主要成分之一，而仙茅苷是仙茅的主要活性成分。因此，仙茅及以仙茅为君药的二仙汤的抗抑郁作用很可能是通过仙茅苷来发挥作用的。