慢性牙周炎患者唾液中miR-193a的表达水平及临床意义分析

张宇辰 刘晶莹 李世英 袁淑静 章慧丰

有研究显示，慢性牙周炎是由牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌等牙周致病菌引起的牙龈和牙周组织的慢性感染性疾病，而牙周致病菌可引起宿主自身的免疫防御和炎症反应并产生大量细胞因子［1］。其中TNF-α、IL-6、IL-8等炎症因子在慢性牙周炎病理过程中发挥重要作用，能引起牙周组织的继发性损伤，进而加重牙周组织的破坏［2］。有研究表明，TNF-α、IL-6和IL-8在慢性牙周炎患者的牙周膜等牙周组织中呈高表达，并且其表达水平随炎症程度的加重而有升高趋势［3］。有研究显示，通过唾液中所含的分子物质可检测多种疾病状态，并且唾液具有与组织、血浆相似的miRNA表达谱，特异性的miRNA在唾液、病变组织和血液中均会发生明显变化［4］。因此，唾液中miRNA具有作为疾病诊断及治疗靶点的潜力。miRNA是非编码内源性小分子RNA，长度约19～24 nt，其在肿瘤、感染性疾病及自身免疫性疾病等的发生及发展中发挥重要作用［5］。大量研究显示，miRNA的异常表达与慢性牙周炎密切相关［6-7］。本研究旨在检测唾液中miR-193a在慢性牙周炎的表达水平，分析其与TNF-α、IL-6、IL-8和IL-14等炎症因子的相关性，探索唾液中miR-193a作为检测慢性牙周炎的生物标志物的意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择2017-06～12于天津市人民医院口腔科就诊的慢性牙周炎患者100例，其中男57例，女43例，年龄21～68岁，平均（44.7±21.9）岁。入组患者均符合1999年牙周病分类国际研讨会制定的慢性牙周炎诊断标准［8］。纳入标准：①无口腔或局部炎症，包括扁桃体炎、咽炎等；②无免疫性疾病、传染病或其他全身性疾病；③近3个月未服用抗生素、未经过牙周基础治疗；④妇女无妊娠及哺乳。另选取本院同期体检的牙周健康者50例作为健康对照组，其中男22例，女28例，年龄24～66岁，平均（46.2±19.3）岁。

1.2 方法

1.2.1 唾液标本采集 于清晨采用棉签法采集慢性牙周炎组和健康对照组受试者的唾液标本。在唾液采集前2 h受试者需空腹，禁止抽烟、剧烈运动及情绪剧烈波动等。采样时受试者采取坐位、头稍前倾，用棉签蘸柠檬酸以刺激唾液分泌，于1.5 min后吐出唾液；然后将唾液标本收集于10 ml无RNA酶的离心管中，立即于4℃下3 000 r／min离心15 min，取上清液；将收集好的唾液上清冻存于-80℃冰箱待检测。

1.2.2 临床牙周指标检查 检查记录牙周临床指标，包括菌斑指数（PLI）、牙龈指数（GI）、牙周探诊深度（PD）和附着丧失（AL）。根据PD、GI、AL以及牙槽骨吸收程度，将慢性牙周炎患者分为3组，轻度牙周炎组（n＝41）：GI＞1，AL为1～2 mm，PD≤4 mm，牙槽骨吸收＜根长1／3；中度牙周炎组（n＝37）：GI＞1，AL为3～4 mm，4 mm＜PD≤6 mm，牙槽骨吸收为根长1／3～1／2；重度牙周炎组（n＝22）：GI＞1，AL≥5 mm，PD＞6 mm，牙槽骨吸收＞根长1／2。

1.2.3 qRT-PCR检测 采用mirVana PARISKit试剂盒（Amhion，加拿大）提取和纯化唾液上清中的总RNA，提取步骤按照试剂盒说明书进行。用Smartspec plus分光光度仪（Bio-Rad，美国）检测唾液上清中提取总RNA的浓度和纯度，进行RNA浓度、纯度、完整性测定。

采用One Step PrimeSeripp miRNA cDNA Synthesis反转录试剂盒（Takara，日本）将提取的总RNA反转录为cDNA，U6作为miR-193a的内参对照；用StepOne Plus实时定量PCR仪（ABI，美国）严格按照试剂盒的操作说明进行miR-193a的RT-PCR检测。将miR-193a反转录产物在95℃下预变性10 min，95℃变性15 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环。每例样品及对照均设3个平行复孔，取平均值。反应结束后，由软件自动得出荧光反应曲线以及每个标本反应体系的扩增效率及Ct值，实验重复3次。

1.2.4 ELISA检测 采用Human TNF-αQuantikine ELISA Kit、Human IL-6 Quantikine ELISA Kit、Human IL-8 Quantikine ELISA Kit、Human IL-14 Quantikine ELISA Kit试剂盒（eBioscience，美国）分别检测唾液上清中TNF-α、IL-6、IL-8和IL-14的含量。取试剂盒中的标准品进行梯度稀释；然后取酶标包被板分别设空白孔、标准品孔、待测样品孔，在相应孔中加入标准品50μl、样品稀释液40μl、待测样品10μl，37℃下温育30 min后，进行洗板、加酶、温育、洗板、显色、终止；加终止液15 min内以空白调零，依序测量各孔450 nm波长的吸光光度值（A值）。

1.2.5 Relative operating characteristic curve（ROC）曲线分析 miR-193a诊断慢性牙周炎的诊断效能通过ROC曲线下面积（AUC）进行计算。0.7≤AUC＜0.8为可接受判别力，0.8≤AUC＜0.9为有好的判别力，ACU≥0.9为有非常好的判别力。

1.3 统计学分析

用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析，计量资料用（）表示，2组样本均数比较采用t检验。检验水准 α＝0.05。

2 结 果

2.1 2组唾液中miR-193a的表达水平

qRT-PCR检测结果示，慢性牙周炎组唾液中miR-193a的表达水平显著低于健康对照组（表1）；提示唾液中miR-193a的表达水平可能与慢性牙周炎相关。

表1 2组唾液中miR-193a的表达水平比较 （）Tab 1 Comparison of the levels of miR-193a in saliva between the 2 groups （）

表1 2组唾液中miR-193a的表达水平比较 （）Tab 1 Comparison of the levels of miR-193a in saliva between the 2 groups （）

组 别 n miR-193a健 康 对 照 组50 1.41±0.34慢性牙周炎组 100 0.89±0.42 P值 ＜0.05

2.2 miR-193a与牙周炎症程度的相关性

对健康对照组以及轻、中、重度慢性牙周炎组唾液中miR-193a表达水平的相对差异分析发现：miR-193a的表达水平随着牙周炎症程度的加重而呈降低趋势，其在重度牙周炎组中的表达水平最低，与健康对照组、轻度牙周炎组相比均有统计学差异（P＜0.05）（表2）；说明，唾液中miR-193a的表达水平与牙周破坏程度呈负相关。

表2 各组唾液中miR-193a的表达水平 （）Tab 2 Expression levels of miR-193a in saliva of the groups（）

表2 各组唾液中miR-193a的表达水平 （）Tab 2 Expression levels of miR-193a in saliva of the groups（）

注：不同上标数字序号为P＜0.05

组 别 n miR-193a健 康 对 照 组 50 1.41±0.34①轻度牙周炎组 41 1.24±0.35②中度牙周炎组 37 0.81±0.11③重度牙周炎组 22 0.75±0.15③

2.3 miR-193a与牙周临床指标的相关性

慢性牙周炎患者牙周临床指标测定结果：PD为（5.15±0.66）mm，AL为（4.36±0.57）mm，PLI为（1.09±0.11），GI为（1.16±0.15）。

将慢性牙周炎患者唾液中miR-193a的表达水平分别与PLI、GI、PD、AL进行相关性分析，结果显示：miR-193a的表达水平与各项牙周临床指标均呈负相关（P＜0.05）（表3）；进一步验证了miR-193a与牙周破坏程度密切相关。

表3 唾液中miR-193a与牙周临床指标的相关性 （r／P）Tab 3 Correlation between miR-193a level in saliva and periodontal clinical indexes （r／P）

2.4 唾液中TNF-α、IL-6、IL-8、IL-14的表达水平

ELISA检测结果显示，慢性牙周炎组唾液中TNF-α、IL-6、IL-8、IL-14的表达水平均显著高于健康对照组（P＜0.05）（表4）。提示，TNF-α、IL-6、IL-8和IL-14可促进慢性牙周炎的发展。

2.5 miR-193a与TNF-α、IL-6、IL-8、IL-14的相关性

将慢性牙周炎组唾液中miR-193a的表达水平分别与TNF-α、IL-6、IL-8、IL-14水平进行相关性分析，结果显示：唾液中miR-193a的表达水平与上述炎症因子的表达均呈负相关（P＜0.05）（表5）；表明miR-193a在慢性牙周炎的发展过程中发挥抑制作用。

表4 2组唾液中各炎症因子表达水平的比较 （）Tab 4 Comparison of the levels of TNF-α，ILl-6，IL-8 and IL-14 in saliva between the 2 groups （）

表4 2组唾液中各炎症因子表达水平的比较 （）Tab 4 Comparison of the levels of TNF-α，ILl-6，IL-8 and IL-14 in saliva between the 2 groups （）

IL-6 IL-8 IL-14健康对照组组 别 TNF-α 4.12±1.98 3.06±1.01 25.41±14.81 18.26±6.17慢性牙周炎组 7.02±2.71 8.14±3.87 55.49±28.01 36.27±19.49 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

表5 唾液中miR-193a与TNF-α、IL-6、IL-8和IL-14的相关性Tab 5 Correlation between mir-193a and TNF-α，IL-6，IL-8 and IL-14 in saliva

2.6 ROC曲线分析

用ROC曲线分析进一步评估miR-193a作为诊断慢性牙周炎的生物标志物潜力，结果显示：唾液中miR-193a的表达水平可有效区分慢性牙周炎组和健康对照组（AUC＝0.785，95%CI：0.706～0.860）；当临界阈值为1.355时，其约登指数最高，诊断慢性牙周炎的灵敏度为70.0%、特异度为83.0%；说明miR-193a有较好的慢性牙周炎检测效能（图1）。

图1 ROC曲线分析miR-193a诊断慢性牙周炎效能Fig 1 ROC analysis of mir-193a in the diagnosis of chronic periodontitis

3 讨 论

有研究显示，唾液中含有炎症因子、病毒样颗粒、RNA等，血清中也能检测到相似的物质，在疾病发生时这些物质含量会随之发生变化，能提示自身免疫性疾病、感染性疾病及内分泌疾病等多种疾病状态［9-10］。Mbulaiteye等［11］研究发现，唾液可替代血液判断机体EB病毒的感染情况。当口腔局部发生炎症时，龈沟液的分泌量升高，溢出龈沟并混入唾液中；因此，龈沟液中所含物质也能在唾液中检出，唾液可能成为慢性牙周炎诊断、治疗及预后疗效评价的重要指标。目前，唾液miRNA已逐渐成为一种新的检测指标，Park等［12］发现，miR-125a和miR-200a在口腔鳞状细胞癌患者唾液中的表达水平明显降低，提示其具有成为口腔癌标志物的潜力。

miRNA参与细胞增殖、分化、凋亡及组织器官的发育等生理过程，并在多种疾病中呈异常表达，进而调控了疾病的进展。研究发现，众多miRNA均与炎症反应或自身免疫相关，而慢性牙周炎是由微生物所引起的牙周组织慢性炎症性疾病，miRNA在慢性牙周炎的病理过程中扮演重要角色［13］。Lee等［14］发现，miR-23a等6种miRNA在牙周炎的牙周组织中呈高表达。有报道显示，miR-23a、miR-30a与成骨分化密切相关［15］。Ogata等［16］发现，相比健康牙龈组织，牙周炎患者的炎性牙龈组织中miR-150、miR-233和miR-200b的表达水平均明显升高，而miR-379、miR-199a-5p和miR-214的表达水平明显降低。目前有关唾液中miR-193a与慢性牙周炎的关系尚鲜有报道。

本实验结果发现，慢性牙周炎患者唾液中miR-193a的表达水平显著低于健康对照组（P＜0.05），并随着牙周炎症程度的加重呈降低趋势，且在重度牙周炎组患者中的表达水平最低。表明唾液中miR-193a的表达水平可能与慢性牙周炎的发生及炎症程度具有相关性。miR-193a的表达水平与牙周临床指标相关性分析的结果发现：患者唾液中miR-193a的表达水平与牙周临床指标PLI、GI、PD、AL均呈负相关；进一步验证了miR-193a与牙周炎症程度密切相关。

促炎症因子和抗炎症因子失衡在慢性牙周炎的病变过程中发挥重要作用，其中TNF-α、IL-6、IL-8、IL-14等炎症因子与炎症、免疫反应进程、牙周组织的破坏密切相关［17］。TNF-α可促进破骨细胞的形成，增强骨吸收活性，抑制牙周膜纤维细胞向成骨细胞转化及成骨细胞活性，导致牙周结缔组织和牙槽骨组织的破坏，进而限制了牙周组织修复［18］；同时，TNF-α还可促进IL-14、IL-6、LI-8、GM-CSF等炎症因子的分泌，进一步加重炎症反应。IL-6可促进炎症介质的释放以加剧炎症反应，抑制牙周膜细胞生长并阻碍牙周膜修复；其还可通过促使破骨前体细胞转化为成熟的破骨细胞，促进牙槽骨吸收，进而诱导基质金属蛋白酶（MMPs）的产生，最终导致骨基质的降解［19］。IL-8主要通过趋化、聚集并激活中性粒细胞，使其发生脱颗粒作用而释放溶酶体酶，导致牙周局部组织炎症性损害［20］。IL-14可促进活化的B细胞增殖及免疫球蛋白的分泌，与免疫系统疾病密切相关，其在慢性牙周炎患者牙周组织及外周血中的表达水平均升高［21］。Beklen等［22］发现，在牙周炎患者牙龈成纤维细胞中TNF-α、IL-1β的表达水平均升高，并诱导MMPs的生成。Takahashi等［23］发现，IL-6在牙周炎患者牙龈组织中呈高表达。Ganlonal等［24］研究发现，在牙周炎患者牙龈组织中IL-8的表达水平明显上调，而在牙周基础治疗后其表达明显降低。

本研究发现，TNF-α、IL-6、IL-8、IL-14的表达水平在慢性牙周炎组唾液中的表达水平与健康对照组比较均明显升高，与Noh等［25］的研究结果相似。提示，TNF-α、IL-6、IL-8、IL-14可促进牙周炎症的发展。为进一步阐明唾液中miR-193a的表达水平与慢性牙周炎的相关性，本研究将miR-193a分别与TNF-α、IL-6、IL-8、IL-14进行相关性分析，结果发现：唾液中miR-193a的表达水平与上述炎症因子均呈负相关；表明miR-193a对牙周炎症具有抑制作用。通过ROC曲线分析发现，miR-193a在唾液中的表达水平可有效区分慢性牙周炎患者和牙周健康人群，并且具有较好的检测效能，具有作为诊断慢性牙周炎的生物标志物潜力。

综上所述，miR-193a对牙周炎症的发生、发展具有抑制作用；慢性牙周炎患者唾液中miR-193a的表达水平与TNF-α、IL-6、IL-8、IL-14炎症因子的表达呈负相关，并且随着牙周炎症程度的加重而显著降低；miR-193a的表达水平还具有较好的慢性牙周炎检测效能。因此，唾液中miR-193a的表达水平可能成为潜在的诊断慢性牙周炎的生物标志物，并可提供新的慢性牙周炎治疗研究方向。