CD105标记的微血管密度在口腔黏膜良性淋巴组织增生病的表达及与临床病理特征的相关性

张昊 李荷香 赵亚男 刘慧娟 刘旭倩 侯亚丽

口腔黏膜良性淋巴组织增生病（benign lymphoadenosis of oral mucosa，BLOM）是一种口腔黏膜癌前病变。但由于其临床表现复杂多样，误诊率高而被研究者忽视。其病因和发病机制不甚清楚，治疗效果不佳。细胞的增殖离不开血管提供的营养，越来越多的证据表明血管生成可能是评估潜在恶性疾病行为的重要因素［1］。微血管密度（microvessel density，MVD）是衡量新生血管生成的一个量化指标。BLOM作为一种癌变率较高的口腔黏膜癌前病变，MVD的表达如何，MVD与BLOM临床病理关系的研究少有报道。本研究采用免疫组织化学方法检测CD105标记的MVD在BLOM中表达情况，探讨其与临床病理特征的关系，评价BLOM中新生血管生成活性，为进一步探讨其发病机制，寻找理想的治疗方法提供线索。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象 30例BLOM蜡块均来自河北医科大学口腔医院病理科作为BLOM组。15例正常黏膜组织取自肿瘤周围正常黏膜作为正常对照组。

1.1.2 试剂 CD105单克隆抗体、PV-9000免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥。

1.2 实验方法

1.2.1 免疫组织化学染色法 将BLOM组和正常对照组蜡块分别切成厚度为3～4μm的切片，常规脱蜡至水，0.01 mol／LPBS冲洗5 min×3次，放入枸橼酸缓冲液中热修复，一抗CD105抗体滴度为1∶100，以后按PV9000试剂盒说明书操作，苏木素复染，无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阳性对照采用已知的阳性组织切片，阴性对照用PBS代替一抗。

1.2.2 MVD计数 分别将BLOM组和正常对照组每张切片在低倍镜（40倍）下选取CD105染色最密集的部位，高倍镜（400倍）下计数。凡呈现棕黄色或棕褐色的单个血管内皮细胞或细胞簇（小于3～5个血管内皮细胞），与邻近结缔组织界限明显者计为一个独立的微血管。每张切片计数3个高倍视野下微血管数目，取其均值，作为MVD值。MVD计数由2名病理科医师采用双盲法完成。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0对数据进行统计学分析。计量资料采用表示，2组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05有统计学意义。各组方差齐性时，多个样本均数间的两两比较采用Bonferroni法检验，调整检验水准为0.017，P＜0.017有统计学意义；若方差不齐时采用Tamhane’s T2法。

2 结 果

2.1 一般情况

BLOM中男性10例（33.3%），平均年龄（56.6±16.8）岁；女性20例（66.7%），平均年龄（57.2±10.8）岁。BLOM病程2～240个月不等，平均病程（21.7±42.9）个月，中位病程12.0个月。30例BLOM患者均无移植宿主疾病、丙型肝炎或艾滋病毒感染；活检前近6个月均没有接受过局部或全身治疗。15例正常黏膜组织取自肿瘤周围正常黏膜作为正常对照组。其中男性7例（46.7%），平均年龄（58.9±10.3）岁、女性8例（53.3%），平均年龄（56.4±8.4）岁。

2.2 临床病理特征

30例BLOM中，发生在颊部23例（76.7%），唇部4例（13.3%），其他部位3例（10%）。糜烂型BLOM 13例（43.3%），临床主要表现为黏膜糜烂溃疡；非糜烂型BLOM 11例（36.7%），临床表现为黏膜白纹或白斑；肿物型BLOM 6例（20%），以鳞状细胞乳头状瘤或纤维上皮息肉为临床表现。

BLOM在显微镜下以淋巴滤泡形成或淋巴细胞灶状浸润为特征，本研究30例BLOM组中21例（70%）BLOM黏膜固有层有淋巴滤泡形成，9例（30%）淋巴细胞灶状浸润。从炎症程度［2］上来看，所有BLOM黏膜上皮下均有不同程度的淋巴细胞和浆细胞浸润，其中轻中度炎症18例（60%），炎细胞局部小灶状浸润或片状浸润；重度炎症12例（40%），炎细胞带状或弥漫浸润。

2.3 免疫组化染色结果

2.3.1 CD105-MVD在BLOM组和正常对照组表达

免疫组织化学染色，CD105定位于血管内皮细胞膜或细胞浆，其阳性微血管呈浅黄色至黄褐色。正常对照组CD105染色阴性（图1）或弱阳性，CD105-MVD计数无或个别几个。BLOM组中CD105染色阳性（图1），高倍镜下观察CD105-MVD主要分布于黏膜上皮下紧邻上皮层或黏膜固有层。2组相比较，BLOM组CD105-MVD计数较正常对照组明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

图1 CD105在正常对照和BLOM组的表达Fig 1 Expression of CD105 in normal control and BLOM groups

表1 BLOM组和正常对照组CD105-MVD计数的比较Tab 1 Comparison of CD105-MVD number between BLOM group and normal control group

2.3.2 CD105-MVD计数与BLOM临床特征的关系

CD105-MVD计数在肿物型、非糜烂型和糜烂型BLOM中依次升高（图2，表2），差异有统计学意义（P＜0.05）。两两比较，CD105-MVD计数仅在肿物型和糜烂型BLOM中有统计学意义（P＜0.001），而在肿物型和非糜烂型BLOM、非糜烂型和糜烂型BLOM中无统计学意义（P＞0.001）。CD105-MVD计数与BLOM年龄、性别、部位和病程无明显相关性（P＞0.05）。

图2 CD105在BLOM的表达 （IHC，×200）Fig 2 Expression of CD105 in BLOM （IHC，×200）

表2 CD105-MVD计数与BLOM中临床特征的关系Tab 2 The relationship between CD105-MVD count and clinical features of BLOM

2.3.3 CD105-MVD计数与BLOM病理特征的关系

CD105-MVD计数在BLOM轻中度炎症组和重度炎症组（图3），其差异有统计学意义（P＜0.05）。CD105-MVD计数和黏膜固有层淋巴滤泡的形成无明显相关性（P＞0.05）（表3）。

3 讨 论

口腔鳞状细胞癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤。口腔癌的发生要经过以下3个过程：正常黏膜——癌前病变——癌。因此，越来越多的人认为防治口腔癌的有效途径是有效治疗口腔癌前病变，将癌变遏制在萌芽状态［3］。BLOM是一种癌变率较高的口腔黏膜癌前病变，但发病机制不甚清楚，至今没有有效的治疗方法。因此探讨其发病机制，寻找新的治疗方法势在必行。

图3 CD105在伴炎症的BLOM中的表达 （IHC，×200）Fig 3 Expression of CD105 in BLOM tissue with inflammation（IHC，×200）

表3 CD105-MVD计数与BLOM病理特征的关系Tab 3 The relationship between CD105-MVD count and pathological features of BLOM

血管生成是肿瘤的标志［4］，是现有血管系统中血管的生长和增殖，这个过程是肿瘤生长、发展和转移的关键因素［5］。评估组织中新生血管的金标准是用特异性内皮细胞标记物如：CD31、CD34、和CD105进行MVD检测［6］。但CD31、CD34是广泛内皮细胞标记物，在所有血管内皮细胞均有表达。而CD105仅在活化增殖的血管内皮细胞和胎盘滋养层细胞中高表达，在静止血管中弱表达或完全不表达［7］。因此，CD105是标记MVD的特异标记物。而且有研究表明应用CD105标记物测定MVD可能是区分癌前病变和癌的一个重要参数［8］，可作为预测患者预后的一个有价值的生物标记物［6］。故本研究采用CD105作为血管内皮细胞标记物，测量其MVD，评估BLOM中新生血管生成活性，为探讨BLOM发病机制，寻找新的治疗方法提供线索。本研究结果显示BLOM组CD105-MVD计数较正常对照组明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。说明MVD和BLOM有明显相关性，在BLOM发生过程中存在明显的血管生成现象，与李曙霞等［9］研究结果一致。BLOM中明显的血管生成可能为口腔黏膜上皮细胞的异常增生和恶变提供基础，有研究者认为新生血管的形成能够使正常的细胞发生遗传学改变而恶变，加速癌前病变向癌的转变［10］。已有研究表明，具有广泛癌前状态的口腔黏膜病，如扁平苔藓［11］、口腔黏膜下纤维化［12］中都有明显的血管生成现象。因此有研究者认为专注于靶向血管形成的各种治疗可以更好地控制潜在恶性疾病向恶性肿瘤的进展［1］为具有恶变潜能的口腔黏膜病的治疗提供了新思路。

本研究在对BLOM临床病理因素如性别、年龄、部位、病程、临床分型与CD105-MVD计数的分析中发现：CD105-MVD计数与患者年龄、性别、部位、病程无明显相关性（P＞0.05）。CD105-MVD计数在肿物型、非糜烂型和糜烂型BLOM中依次升高（P＜0.05）。但两两比较，CD105-MVD计数仅在肿物型和糜烂型BLOM中有统计学意义（P＜0.001 7）。而在肿物型和非糜烂型BLOM、非糜烂型和糜烂型BLOM中无统计学意义（P＞0.001 7）。推测不同临床分型的BLOM其发病机制可能不同。BLOM是一种炎症性疾病，黏膜固有层有不同程度的淋巴细胞和浆细胞浸润。本研究结果显示CD105-MVD计数和炎症程度相关：轻中度炎症组BLOM CD105-MVD计数明显低于重度炎症组，差异有统计学意义（P＜0.05）。推测可能是由于黏膜固有层炎细胞的浸润刺激口腔黏膜上皮细胞增生，导致缺氧，血管生成增加。增加的血管反过来又可能导致更多淋巴细胞的募集和停留，从而导致炎症浸润加重、疾病进展或复发［1］。课题组推测靶向血管形成的各种治疗是否可以尝试应用于BLOM的治疗？或者治疗BLOM的同时辅以抗炎治疗，是否能够提高BLOM治疗效果，有待进一步探讨研究。BLOM以黏膜上皮下淋巴滤泡形成或淋巴细胞灶状聚集为病理特征。本研究结果显示CD105-MVD计数在黏膜固有层有淋巴滤泡形成组和淋巴细胞灶状聚集组无统计学意义。说明CD105-MVD计数和淋巴滤泡的形成无明显相关性，其形成可能是由于细菌、病毒等某种刺激因素刺激黏膜组织形成［13］。

综上所述，BLOM中有明显的血管生成现象，CD105可能参与了其中的血管形成，为具有恶变潜能的BLOM治疗提供了新思路。