miR-146a-5p对人牙髓干细胞成牙本质分化的影响

邱在玲 林诗晗 曾建钗 柯志红 肖婷婷 吕红兵

人牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）和根尖牙乳头干细胞（stem cells from the apical papilla，SCAPs）是牙髓组织工程理想的细胞来源。研究发现，DPSCs和SCAPs具有相似的骨／牙本质发生和生长因子受体基因［1］，但SCAPs呈现出更活跃的增殖和更强的成牙本质生成能力［2］，与DPSCs相比，SCAPs可能是一种更早期的牙源性干细胞，并且成为组织再生更加优越的细胞来源［3］。然而SCAPs临床上来源更少，获取难度相对较大。因此，是否能够通过改变DPSCs的干性状态从而取代SCAPs，在牙髓再生中发挥重要的作用。

越来越多的证据表明，miRNA在干细胞生物学中起着至关重要的调控作用［4-7］。前期研究采用二代测序技术，检测DPSCs和SCAPs中miRNAs的表达，筛选差异表达的miRNAs，发现与DPSCs相比，SCAPs中表达下调超过1.5倍的miRNAs有7个（miR-224-5p、miR-1247-5p、miR-3065-3p、miR-452-5p、miR-767-5p、miR-4284、miR-146a-5p），无表达上调miRNAs［8］。本研究将通过qRT-PCR验证差异miRNA的表达，进一步对特异miRNA在DPSCs和SCAPs干性维持中的调控作用做初步探索。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

酶标仪（Heraeu，德国）；PCR仪（Eppendorf，德国）；LightCycler480实时荧光定量PCR扩增仪（Applied Biosystems，美国）；倒置相差荧光显微镜（Olym-pus，日本）；α-MEM、胎牛血清、胰蛋白酶（Gibco，美国）；Ⅰ型胶原酶、dispase II酶、β-甘油磷酸钠、地塞米松、抗坏血酸（Sigma，美国）；鼠抗人STRO-1单克隆抗体（R＆D systems，美国）；免疫磁珠（Miltenyi Biotec，德国）；Trizol总RNA提取试剂（Invitrogen，美国）；逆转录试剂盒、PCR试剂盒（Takara，日本）；慢病毒（上海吉凯基因化学技术有限公司）；碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒（南京建成生物科技有限公司）；茜素红（南京森贝伽生物科技有限公司）。

1.2 人牙髓细胞和根尖牙乳头细胞的分离和培养

选取福建医科大学附属口腔医院口腔颌面外科17～20岁健康的第三磨牙，拔除后立即放入预冷的培养基中保存，4 h内原代取材。无菌条件下取出牙髓或分离根尖牙乳头组织，每个组织块体积在1 mm3左右，CD酶（I型胶原酶3 mg／ml，dispase II酶4 mg／ml）37℃消化30 min，离心后加入含10%胎牛血清的α-MEM培养液，细胞筛过滤，获得单细胞悬液，37℃、5%CO2孵育箱中培养，24 h后换液。细胞生长达70%～80%汇合时传代，取第3代细胞进行后续实验。

1.3 免疫磁珠分选DPSCs和SCAPs

分别取1×107对数生长期的DPSCs和SCAPs，加入鼠抗人STRO-1单克隆抗体，4℃孵育15 min，用4 ml running buffer清洗细胞，去除残留的抗体。加入免疫磁珠4℃孵育15 min，再次加入不少于4 ml running buffer洗涤。然后用MACS磁柱分选STRO-1阳性DPSCs和SCAPs。

1.4 实时荧光定量PCR

按说明书用Trizol reagent提取总RNA。对于miRNA，采用Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit试剂盒，Poly（A）加尾反应和反转录反应一步完成。荧光定量PCR使用SYBR Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）进行，以U6为内参，用试剂盒中提供的mRQ 3’Primer及自行设计的miRNA Specific Forward Primer对miRNA进行定量解析。对于mRNA，按PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Erase试剂盒和SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）试剂盒说明要求进行逆转录和扩增。引物由上海生工合成，PCR引物序列见表1。每个样本设3个复孔，采用2-ΔΔCt法计算每个样本miRNA或mRNA的相对表达量。

1.5 慢病毒转染

慢病毒载体由上海吉凯基因化学技术有限公司构建并包装。慢病毒载体携带增强绿色荧光蛋白（EGFP）和嘌呤霉素抗性基因。将细胞用胰蛋白酶消化后，以每孔5×105细胞数接种于6孔板内，放置于37℃、5%CO2培养箱内常规培养24 h后，加入5μg／ml polybrene，感染复数MOI为50，将miR-146a-5p过表达慢病毒（miR-146a-5p overexpression）和空载对照病毒（empty vector，EV）转染到DPSCs。EGFP可以通过显微镜进行观察。2μg／ml嘌呤霉素用于筛选成功转染慢病毒的DPSCs。随后收集各组细胞通过qRTPCR验证转染效率，以及进行后续实验。

表1 实时荧光定量PCR引物序列Tab 1 Primer sequences used in real time PCR assay

1.6 ALP活性检测和茜素红染色

成牙本质分化培养基诱导7 d后，RIPA buffer用于裂解细胞，并且应用BCA试剂盒测定各组细胞蛋白浓度，然后通过ALP试剂盒（碧云天）以及吸光光度法检测ALP活性，实验步骤参照其说明书。诱导21 d后，弃培养基，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，用1%pH 4.1茜素红染色液染色10 min，蒸馏水轻轻冲洗3次后显微镜下观察矿化结节并拍照。成牙本质分化诱导液：α-MEM+10%FBS+10 mmol／Lβ-甘油磷酸钠+50μg／ml VitC+10 nmol／L dex（地塞米松）。

1.7 统计学分析

2 结 果

2.1 DPSCs和SCAPs中差异表达的miRNAs的qRTPCR验证

实时荧光定量PCR结果表明，miR-224-5p、miR-1247-5p、miR-452-5p、miR-767-5p、miR-4284和miR-146a-5p在DPSCs中的表达均高于SCAPs，其中miR-146a-5p表达差异最大，在DPSCs中miR-146a-5p的表达量约为SCAPs的10倍（10.549±1.247，P＜0.05）。而miR-3065-3p的表达在DPSCs和SCAPs中无明显差异（图1）。

图1 DPSCs和SCAPs中miR-224-5p、miR-1247-5p、miR-3065-3p、miR-452-5p、miR-767-5p、miR-4284和miR-146a-5p的表达Fig 1 Relative expression of miR-224-5p，miR-1247-5p，miR-3065-3p，miR-452-5p，miR-767-5p，miR-4284 and miR-146a-5p in DPSCs and SCAPs

2.2 转染效率检测

DPSCs转染miR-146a-5p过表达慢病毒后，qRTPCR显示，miR-146a-5p表达相比于阴性对照病毒组上升约50倍（50.727±7.658，P＜0.05），转染效果明显（图2）。

图2 过表达慢病毒转染DPSCs后miR-146a-5p的表达Fig 2 Relative expression of miR-146a-5p in DPSCs after transfection with miR-146a-5p overexpression lentivirus

2.3 ALP活性检测和茜素红染色结果

诱导7 d后，ALP活性检测表明诱导DPSCs成牙本质定向分化时，miR-146a-5p过表达组ALP活性明显高于对照组，P＜0.05。21 d后茜素红染色发现，转染miR-146a-5p过表达慢病毒后，实验组较对照组染色加深（图3）。

图3 转染miR-146a-5p过表达慢病毒对DPSCs的成牙本质分化能力的影响Fig 3 The role of miR-146a-5p in the odontogenic differentiation of DPSCs

2.4 诱导后成牙本质相关基因的检测

成牙本质分化培养基诱导14 d后，qRT-PCR结果显示，miR-146a-5p过表达组相比于对照组ALP表达上升约4倍（4.215±0.224，P＜0.05），DSPP表达上升约2倍（2.094±0.419，P＜0.05）（图4）。

图4 转染并成牙本质诱导后成牙本质相关基因的表达Fig 4 The odontogenic marker gene expression after transfection with miR-146a-5p overexpression lentivirus and odontogenic induction

3 讨 论

DPSCs与SCAPs是干性状态不同的2种牙源性干细胞，SCAPs可能是组织工程更理想的细胞来源，但DPSCs由于获取条件相对宽松，在组织工程中得到了更加广泛的运用，然而DPSCs分化程度相对较高，分化为成牙本质的能力较弱，因此许多学者都在尝试各种增强DPSCs干性、促进组织再生的方法。miRNAs参与调控生物体生长发育等许多复杂的生命过程，在维持干细胞的自我更新和调控多向分化等方面具有重要影响。

前期研究采用二代测序技术，筛选DPSCs与SCAPs中差异表达的miRNAs，超过1.5倍且P＜0.05的差异miRNA有7个：miR-224-5p、miR-1247-5p、miR-3065-3p、miR-452-5p、miR-767-5p、miR-4284、miR-146a-5p［8］。本研究qRT-PCR结果显示，miR-224-5p、miR-1247-5p、miR-452-5p、miR-767-5p、miR-4284和miR-146a-5p在SCAPs中表达均下调，与测序结果相一致，而miR-3065-3p表达无明显差异，这可能是由于高通量测序技术进行测序，虽然能够产生大量的测序数据，但是同样存在一定的假阳性或假阴性，因此本研究进一步通过qRT-PCR验证测序结果。发现miR-146a-5p在DPSCs与SCAPs中表达差异最大，因此猜想miR-146a-5p的表达可能与DPSCs与SCAPs的干性状态不同有关。

miR-146a是miR-146 miRNA家族（由两个进化保守的miRNA基因组成：miR-146a和miR-146b）的成员，已被证实参与多种干细胞增殖、分化和凋亡等反应的调控。研究发现miR-146a-5p的表达与人骨髓间充质干细胞的衰老状态有关［9］。并且，miR-146a能够促进血管内皮生长因子的表达以及人骨髓间充质干细胞的血管生成［10］。过表达miR-146抑制小鼠神经嵴干细胞的增殖，而促进分化［11］。而miR-146a-5p是否参与调控DPSCs的干性状态目前尚不清楚，需进一步研究。本实验通过慢病毒感染手段过表达DPSCs中miR-146a-5p，检测其对DPSCs成牙本质分化能力的调控作用。此慢病毒转染系统属于稳定转染，其转染效果满足本实验较长时间点的要求。本实验所用慢病毒载体为GV369，携带嘌呤霉素抗性基因，当慢病毒转染细胞后，可用嘌呤霉素杀灭未被转染的细胞，从而达到筛选稳定转染的DPSCs的目的。在经过特异性过表达之后，miR-146a-5p表达显著增高，说明转染效果较高。

本研究结果显示，经过21天的矿化诱导，过表达miR-146a-5p茜素红染色更深，并且形成更多、更明显的矿化结节，表明miR-146a-5p在DPSCs向成牙本质细胞分化过程中，促使DPSCs分泌了更多的矿化基质。DSPP（牙本质涎磷蛋白）是牙本质中最丰富的非胶原蛋白，在牙本质形成和生物矿化过程中起着重要的作用［12］。本实验发现，过表达组DSPP的表达明显高于对照组。ALP也是DPSCs成牙本质细胞向分化的重要矿化标志，ALP活性和qRT-PCR检测，均显示过表达组ALP表达显著增加。

以上结果表明miR-146a-5p可以促进DPSCs向成牙本质细胞分化，推测低水平的miR-146a-5p可能有利于DPSCs体外扩增时维持低分化状态，成为牙齿组织工程和牙髓组织再生中更好的细胞来源。但miR-146a-5p在DPSCs向成牙本质细胞分化及干性调控中的具体机制还没有完全阐明，需进行进一步的研究。