生物活性玻璃对早期根面龋再矿化的研究
2019-12-05高鹏彭伟李慧张炜武孟琳
高鹏 彭伟 李慧 张炜 武孟琳
根面龋是老年人及牙周病患者最常见的牙体硬组织疾病，随着年龄的增长根面龋的患病率也在逐步增高［1］。由于根面龋广泛的流行性、口腔临床损害的特殊性及龋损位置的隐蔽，使治疗难度加大且疗效不佳，因此对于根面龋的防治尤为重要。前期实验已经证实生物活性玻璃对牙釉质与牙本质有再矿化作用［2-3］，国内外对于生物活性玻璃促进早期根面龋再矿化的作用未见报道。本研究通过建立早期根面龋模型，通过原子力显微镜与荧光显微镜观察生物活性玻璃（BAG）、酪蛋白磷酸肽-无定形磷酸钙（CPP-ACP）、氟化钠（NaF）处理脱矿牙骨质后的表面结构形态、粗糙度、荧光面积与总荧光量，讨论生物活性玻璃对早期牙骨质龋的再矿化作用。
1 材料与方法
1.1 药品与仪器
生物活性玻璃（北京刷新活力）；人工唾液（ISO／TR10271标准）［4］：NaCl 0.8 g、KCl 0.8 g、CaCl2·2H2O 1.59 g、NaHPO4·2H2O 1.56 g、Na2S·2H2O 0.01 g、Urea 2 g、DDW 2 000 ml，pH＝7.0；人工酸蚀液（酸性缓冲液）：Ca（NO3）22.2 mmol／L、KH2PO42.2 mmol／L、CH3COOH 50 mmol／L，pH＝4.7；中性缓冲液：20 mmol／L HEPES，1.5 mmol／L KH2PO4，pH＝7.0。原子力显微镜（Agilent，5600LS，德国）；荧光显微镜（O-lympus，BX53，日本）；扫描电子显微镜 （Hitachi，S3400N，日本）往复水浴恒温箱（SHA-CA，江苏新宝）；超声震荡机（KQ-600DE，昆山舒美），硬组织切骨机（QGJ-1A，上海珂淮）；抗酸指甲油（美宝莲，美国）。
1.2 方法
1.2.1 标本的选择与制备 选择华北理工大学口腔医学院口腔颌面外科因正畸治疗而拔除的双侧下颌第一前磨牙20颗（年龄在18～22岁，单根管下颌第一前磨牙，患者已知情同意签署知情同意书，符合华北理工大学伦理委员会审核批准）。体视显微镜（×20）下筛选无裂痕、龋损及充填物且牙根发育完全的牙齿，去除根面牙周纤维等软组织，去离子水超声振荡10 min，位于秞牙骨质界下2 mm进行冠根分离，再用硬组织切骨机将牙根切割成4 mm×3 mm×2 mm的牙骨质块40个，放置于0.05%麝香草酚去离子水中4℃保存，实验区外均用抗酸指甲油覆盖备用［5］。
1.2.2 实验分组与早期牙骨质龋模型建立 将40枚牙骨质块随机分为4组，A（BAG组）、B（CPP-ACP组）、C（NaF组）、D（DDW组）平均每组10枚牙骨质块，放置在37℃恒温水浴箱内进行为期96 h脱矿，脱矿后在去离子水中超声振荡5 min，形成70～100μm龋损深度的早期根面龋模型［6］。人工龋成功标准：牙骨质块表面出现白垩色改变，电子显微镜下观察牙骨质块表面粗糙，有蜂窝状结构产生［7］。
1.2.3 pH实验循环［4］将A、B、C、D组样本：分别进行再矿化处理（BAG、CPP-ACP、2%NaF、去离子水）小毛刷涂擦5 min→中性缓冲液5 min→人工唾液中浸泡3.5 h→酸性缓冲液50 min→人工唾液中浸泡3.5 h，每次更换新配置溶液前使用去离子水冲洗1 min，按照此循环3次／d，共计20 d，分别在37℃摇动恒温水浴箱中进行，循环结束后分别在去离子水中冲洗5 min晾干。
1.2.4 牙骨质样本检测 各组样本于脱矿前、脱矿后及再矿化后随机选出5块于原子力显微镜下扫描范围5μm观察其形态自带软件测得粗糙度，剩余样本用慢速切割机在流水下切取350μm后薄片，使用0.1 mmol／L罗丹明B染料染色60 min，超声荡洗脱色10 min，清洗、吹干、封片，使用Image Pro-Plus 6.0软件分析牙骨质块荧光量面积（A）单位 μm2；总荧光量（TF）；平均荧光量（AF）［8］收集数据整理。
1.3 统计学分析
采用SPSS 17.0软件进行统计分析。使用单因素方差分析及SNK两两比较，假设检验水准P＝0.05。
2 结 果
2.1 原子力显微镜观察结果与粗糙度
通过AFM观测BAG、CPP-ACP、NaF、DDW处理前后牙骨质片的表面形态，脱矿前牙骨质表面比较粗糙，高度起伏不平，脱矿后牙骨质表面更加粗糙，有微凹坑的存才，经BAG、CPP-ACP、NaF再矿化处理后的牙骨质表面相对光滑（图1）；4组样本处理后的粗糙度值（Ra值）测试结果（表1），4组牙骨质片脱矿前与脱矿后粗糙度值无统计学差异，再矿化后各组与脱矿后比较粗糙度值均有明显降低，差异有统计学意义。再矿化后各组比较：BAG组、NaF组与CPP-ACP组粗糙度值明显低于DDW组，差异有统计学意义；BAG组与NaF组粗糙度值无统计学差异（P＞0.05），BAG组与NaF组粗糙度值明显低于CPP-ACP组（P＜0.05），差异有统计学意义。
表1 各组牙骨质块的粗糙度 （n＝5，）Tab 1 The cementum roughness of the groups（n＝5，）
表1 各组牙骨质块的粗糙度 （n＝5，）Tab 1 The cementum roughness of the groups（n＝5，）
注：a与b比：P＜0.01；①与②比：P＜0.05；②与③比：P＜0.05；①与③比：P＞0.05
组别 脱矿前（μm）再矿化前（μm）再矿化后（μm）BAG 3.78±0.19 5.18±0.19 3.18±0.34a ①＞0.05 ＞0.05 ＜0.01 CPP-ACP 3.75±0.14 5.24±0.32 3.92±0.46a②NaF 3.62±0.11 5.12±0.20 3.22±0.12a③DDW 3.64±0.16 5.37±0.26 4.85±0.28b F值 1.28 0.97 29.15 P值
2.2 荧光显微镜结果
荧光显微镜镜下观察可见脱矿前牙骨质样本荧光条带较浅，脱矿后荧光条带明亮，大部分牙本质荧光明亮。BAG组处理的牙骨质荧光条带与其他组比较较浅。单因素方差分析显示BAG组、NaF组与CPP-ACP组的A、TF均低于DDW组（P＜0.05），BAG组的A、TF均低于NaF组与CPP-ACP组，CPP-ACP组与NaF组的A、TF无统计学差异（P＞0.05）。各组间AF无统计学差异（AF＞0.05）（表2，图2）。
图1 牙骨质表面AFM图像Fig 1 AFM image of cementum surface
图2 牙骨质表面荧光显微镜图像 （IFM，×20）Fig 2 IFM image of cementum surface （IFM，×20）
表2 各组牙骨质块再矿化后荧光染色情况 （n＝5，）Tab 2 The remineralized fluorescence area of the groups （n＝5，）
表2 各组牙骨质块再矿化后荧光染色情况 （n＝5，）Tab 2 The remineralized fluorescence area of the groups （n＝5，）
注：各组内比较字母不同的表示有统计学差异（P＜0.05）；符号相同表示无统计学差异（P＞0.05）
组别 A（×104，μm2） TF（×107，a.u.） AF（a.u.）BAG 84.41±2.77d 19.41±1.13g 250.50±2.25*＜0.01 ＜0.05 ＞0.05 CPP-ACP 101.46±3.68c 23.83±1.38f 234.80±6.89*NaF 104.07±5.64c 24.48±1.81f 235.58±17.41*DDW 126.43±2.39e 29.22±5.02h 230.70±36.93*F值 101.34 10.17 0.86 P值
3 讨 论
原子力显微镜分辨率高，可分辨出纳米级别形貌特征，水平向分辨率可达0.1 nm纵向分辨率可达0.01 nm，分辨能力超过电镜，Frank等［9］利用原子力显微镜的压痕技术，观察了人体内与体外牙釉质表面脱矿和再矿化现象，本实验采用原子力显微镜很直观的观察到牙骨质脱矿后的粗糙表面以及凹坑状结构，并且从三维立体的形貌外观观察到再矿化后表面粗糙度降低以及凹坑减少或消失的表征，为使用原子力显微镜进行牙骨质研究提供理论依据。
生物活性玻璃（45S5）由Na2O-CaO-SiO2-P2O5四元系统构成，能够紧密的与骨接触不易脱落且刺激骨生长［10］。2004年英国葛兰素史克公司研究发现，BAG在牙本质层表面形成硅酸盐与类羟基磷灰石封闭牙本质小管，可以降低牙齿敏感从而替代了传统牙膏中的硝酸钾等脱敏药物的单一处理［11］，并将BAG制成凝胶，在临床中用于牙本质脱敏［12-13］。本课题组前期实验证实生物活性玻璃可以促进早期釉质龋的再矿化［2］，本研究证实，经BAG、CPP-ACP与NaF处理的牙骨质在原子力显微镜下可见牙骨质粗糙度值均有明显降低，荧光显微镜下荧光条带面积与荧光总量均有明显降低，表明BAG、CPP-ACP与NaF对早期根面龋都有一定的再矿化作用；但BAG与NaF的再矿化作用要强于CPP-ACP，分析原因，可能是BAG与唾液接触后释放Na+，造成局部弱碱环境，有利于形成类羟基磷灰石，促进了牙体组织表面再矿化［14-15］。BAG的再矿化机制除与钙磷有关，还与牙骨质表面形成硅酸盐有关，可更好地在牙骨质表面沉积，促使再矿化的进行。本课题组前期研究表明生物活性玻璃可以诱导l929细胞以及成牙骨质细胞的增殖分化［16］，另外Leppäranta等［17］通过长期试验证实生物活性玻璃对17种厌氧菌与需氧菌有抑制作用，Waltimo等［18］研究发现BAG在牙周袋内能够对革兰氏阴性菌有抑制作用。因此对于牙周炎牙槽骨吸收而引起的根面龋，生物活性玻璃有着不可替代的优势，一方面可以促进牙周组织的再生，另一方面还能促进牙骨质再矿化，同时对细菌还有一定的抑制作用，因此生物活性玻璃用于防治根面龋有着广阔的前景。
