50个国外小麦品种(系)抗叶锈性鉴定

焦 悦,王思曼,赵喜兰,张培培,郑慧敏,李在峰,刘大群，2

(1.河北农业大学 植物保护学院/河北省农作物病虫害生物防治工程技术研究中心，河北 保定 071001；2.中国农业科学院 研究生院，中国 北京 100081)

小麦叶锈病是由小麦叶锈菌(Pucciniatriticina)引起的小麦常见病害之一，该病害为气传真菌病害，严重危害小麦的生长发育，在流行年份造成的产量损失可达50%左右[1]。目前，化学防治能有效控制小麦叶锈病，但过量使用化学药剂不仅会造成农药残留、环境污染，还容易使小麦叶锈菌产生抗性。因此，培育和合理利用抗病品种是解决该病害最经济、有效和安全的措施[2]。一般小麦对叶锈病的抗性分为小种专化抗性和非小种专化抗性，小种专化抗性由单基因或少数基因控制，又叫垂直抗性或苗期抗性，这种抗性易随病原菌生理小种的变异而丧失。非小种专化抗性由多个微效基因控制，也称为水平抗性或成株期抗性，在苗期表现感病，在成株期具有较低的发病严重度并且抗性持久[3-4]，亦称为慢锈性。非小种专化抗病基因目前广泛用于培育具有持久抗病性品种[5]。目前，已发现的小麦抗叶锈基因有100多个，被正式命名的有79个[6]，大部分为苗期抗病基因，其中Lr34[7]、Lr46[8]、Lr67[9]和Lr68[10]为非小种专化抗病基因，亦称为成株期慢锈基因。

目前，人们一般利用基因推导并借助分子标记鉴定小麦抗叶锈基因。由LOEGERING等[11]提出的基因推导法，是以FLOR[12]提出的基因对基因假说为依据，在含有已知小麦叶锈病抗性基因的近等基因系(或单基因系)和试验材料上接种不同毒力的菌种，然后分别将试验材料的侵染型与近等基因系的侵染型进行对比，以此推导出供试材料中所携带的抗病基因。BROWDER[13]利用近等基因系成功推导出了Lr1和Lr10。LI等[14]鉴定了102个中国小麦材料，推导出Lr1、Lr2a、Lr3bg、Lr3ka、Lr14a、Lr16、Lr17a、Lr18、Lr20、Lr23、Lr24、Lr26、Lr34、LrZH84共14个基因可能存在于65个品种(系)中，在 37个品种(系)中可能含有未知抗病基因。GAO等[15]运用基因推导结合分子标记在四川省小麦材料中鉴定出Lr1、Lr2a、Lr26、Lr3ka、Lr30、Lr36、Lr15、Lr37和Lr46共9个抗病基因。对50个国外小麦品种(系)的抗叶锈病基因进行苗期和成株期抗性鉴定，为培育抗病品种提供遗传信息支撑。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料：50个国外小麦品种(系)、36个含有已知小麦抗叶锈基因的载体品种(单基因系)，苗期感病对照品种(CK)为郑州5389、成株期慢锈对照品种(CK)为SAAR，以上材料均由河北农业大学小麦锈病研究中心提供。用于苗期基因推导的20个叶锈菌生理小种为PHST、PRSQ、FHTQ、PHJM、KHGQ、PHTT①、TGTT、PHQS、FHJQ、NHKT、PHTT②、THGS、FGGJ、DGGS、FGBR、CBGB、KHTP、FBJN、FHGN、FHJQ；用于成株期慢锈性鉴定的 4个强毒力生理小种混合菌种为THTS、THTQ、PHPS、THTT。参照LONG等[16]提出的四字母命名法对生理小种进行命名。菌种材料均由河北农业大学小麦锈病研究中心进行扩繁和保存。

1.2 试验方法

1.2.1 苗期抗叶锈性鉴定 苗期试验在温室中进行，将50个国外小麦品种(系)、含有已知小麦抗叶锈病基因的36个载体品种(单基因系)及苗期感病对照品种(CK)郑州5389，按顺序播种于穴盘内，每孔6～8粒小麦，共播种20套。待小麦长到一叶一心时，将20个叶锈菌分别接种到麦苗上，并将接种后的小麦在黑暗条件下保湿。第二天将麦苗置于25 ℃左右日光温室内，待郑州5389发病完全，进行苗期鉴定。侵染型鉴定参照 ROELFS等[17]提出的方法加以完善，具体侵染型鉴定标准见表1。为确保结果的准确性，本试验每个材料进行2次重复。最后根据基因对基因假说，推导出供试材料中可能携带的抗叶锈病基因。

表1 叶锈菌侵染型鉴定分级标准

1.2.2 成株期抗叶锈性鉴定 50个国外小麦品种(系)分别于2016年10月、2017年10月中旬播种于河北省保定市和河南省周口市试验田。每个品种(系)播种50粒左右，行长1.5 m、行距0.3 m。每播种9行小麦材料之后播种1行郑州5389作为对照(CK)，试验圃周围播种郑州5389作为诱发行，试验期间每年的4月上旬、中旬分别在周口市和保定市对诱发行接种叶锈菌混合菌种。当对照郑州5389叶片上叶锈病斑面积占总叶片的50%时，开始调查小麦叶锈病的发病情况。采用PETERSON等[18]提出的方法进行鉴定，每7 d调查1次，当对照品种严重度达到100%时，将调查结果作为最终严重度(Final disease severity，FDS)。统计50个品种(系)在2个环境下的FDS。利用软件SAS对FDS进行方差分析，通过FDS与慢锈对照(CK)SAAR的严重度进行比较，筛选小麦慢锈品种(系)。

1.2.3 小麦抗叶锈病基因分子鉴定 参照SHARP等[19]提出的CTAB法提取50个国外小麦品种(系)、郑州5389及36个载体品种的基因组DNA，用紫外分光光度计检测DNA的浓度和纯度，再用1×TE将DNA 稀释至最终质量浓度40 ng/μL备用。

利用与已知抗叶锈基因紧密连锁的12对分子标记Lr1、Lr9、Lr10、Lr19(2对)、Lr20、Lr24、Lr26(2对)、Lr34、Lr37和Lr46对50个国外小麦品种(系)进行分子标记检测，引物序列及扩增条件如表2所示。PCR扩增体系均为20 μL：2 μL DNA、10 μL 2×TaqPCR Mix、2 μL引物、6 μL ddH2O，产物以1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。其中Lr46存在CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequence，切割扩增的多态性序列)标记的标记酶识别位点，需将第1次扩增产物酶切，进行第2次扩增，产物用12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

表2 研究所用分子标记的引物序列及PCR扩增程序

续表2 研究所用分子标记的引物序列及PCR扩增程序

2 结果与分析

2.1 苗期基因推导和标记检测结果

通过对比36个载体品种和50个国外小麦品种(系)的抗性表现，推导50个国外小麦品种(系)中所含抗叶锈病基因(表3—4)。鉴定结果表明，测试品种(系)RL6010、RL6040、RL6064、RL6079、RL6080、C98.006和C78.5均表现高抗甚至免疫，不能断定Lr9、Lr19、Lr24、Lr28、Lr29、Lr47和Lr51等基因是否存在于上述供试材料中，RL6047、RL6002、Hussar、RL6051和RL6057均表现高度感病，亦不能断定Lr2c、Lr3、Lr11、LrB和Lr33等基因是否存在于上述供试材料中。Insijnia、Palpich、MV laura、Mason/jagger、Re7145共5个品种(系)对20个叶锈菌的抗性与Lr1相比具有相似的抗性反应或更广的抗性谱，根据基因对基因假说，该5个品种(系)可能含有Lr1。Insijnia、Tx03a0148、F98047j14-zinc、T67/X84w063-9-45//K92、Mason/jagger共5个品种(系)对Lr26无毒力的菌种也表现为抗病，可能含有Lr26。T67/X84w063-45//K92、Re7145共2个品种(系)可能含有Lr18。Fr03724、Fr3713、T67/X84w063-9-45//K92共3个品种(系)可能含有Lr21，T67/X84w063-9-45//K92仅1个品种(系)可能含有Lr36。

与Lr1连锁的STS标记引物WR003在Insijnia、Palpich、MV laura、Mason/jagger、Re7145共5个品种(系)中均扩增出1条760 bp的特异性条带，表明该5个品种(系)含有Lr1，与基因推导结果一致。Insijnia、Tx03a0148、F98047j14-2inc、T67/X84w063-9-45//K92、Mason/jagger共5个品种(系)中扩增出1条1 076 bp的ω-seclin片段，说明该5个品种(系)含有Lr26，与基因推导结果一致。在50个国外小麦品种(系)中均未检测到Lr9、Lr10、Lr19、Lr20、Lr24。另外，由于Lr34，Lr46和Lr37为成株期抗病基因，在苗期表现感病，不能进行苗期基因推导，其分子标记检测结果表明，Hk1/6/Nvsr3/5bez/tvr、Tx03a0148、Palpich、Kanto107、MV laura、F92080g1-1/F93042g2-1、Mv05-08、Norin61、Bruta、Aca801、F98047j14-2inc、T67/X84w063-9-45//K92、Mason/jagger共13个品种(系)含有Lr34，Nidera baguette 10、Insijnia、Nsa09-3645、Soissons、Aztec、Carimulti、Mason/jagger、Re714、Kniish-46、Nuwest/4/D887-74/pew/、Fr03733共11个品种(系)含有Lr37，Sagittario、Hk1/6/Nvsr3/5bez/tvr、Insijnia、Fr03717、Dorico 等45个品种(系)含有Lr46(表4)。

2.2 成株期抗病鉴定结果

经方差分析(表5)可知，品种间、环境间、品种与环境间的差异均极显著，品种与重复间差异不显著，说明小麦抗叶锈病的表达受基因型和环境共同影响。利用SAS软件，根据LSD方法(表6)分析可知，慢锈对照SAAR表现明显的慢锈性，共有Mv05-08、Fr03725、Re714、Fr03717、Fr03724等19个品种(系)与慢锈对照SAAR 的FDS无明显差异，表现出慢锈性。

表3 供试20个菌系与36个载体品种抗叶锈基因相互作用产生的苗期侵染型

注：+表示夏孢子堆比正常的大；-表示夏孢子堆比正常的小。下同。

Note:+indicates uredia larger than normal;-indicates uredia smaller than normal.The same below.

表4 供试20个菌系与50个国外小麦品种(系)相互作用产生的苗期侵染型

续表4 供试20个菌系与50个国外小麦品种(系)相互作用产生的苗期侵染型

注：基因鉴定结果中，a表示该基因是基因推导鉴定出来的；b表示该基因是分子标记检测出来的；+表示未知基因。

Note:In the gene identification results,a indicates that the gene is genetically deduced;b indicates that the gene is detected by molecular marker detection;and + indicates unknown genes.

表5 2016—2017和2017—2018年50个国外小麦品种(系)成株期FDS方差分析

表6 2016—2017和2017—2018 年50个国外小麦品种(系)苗期对混合小种的抗性及成株期FDS

续表6 2016—2017和2017—2018 年50个国外小麦品种(系)苗期对混合小种抗性及成株期FDS

3 结论与讨论

发掘国外小麦品种中丰富的抗叶锈病基因并利用到抗病育种中，将极大地丰富我国小麦品种抗病基因。本研究仅选取了36个已知基因进行基因推导，因此，供试品种(系)中很可能还含有这36个抗叶锈病基因之外的抗病基因。本研究选用的是20个毒力不同的叶锈菌小种，尽管能推导出一些抗叶锈病基因，但由于测试品种(系)RL6010、RL6040、RL6064、RL6079、RL6080、C98.006和C78.5均表现高抗甚至免疫，因此不能断定Lr9、Lr19、Lr24、Lr28、Lr29、Lr47和Lr51在50个国外小麦品种(系)中是否存在。测试品种(系)中RL6047、RL6002、Hussar、RL6051和RL6057都表现高度感病，因此不能确定50个国外小麦品种(系)中是否含有Lr2c、Lr3、Lr11、LrB和Lr33等基因。

在50个国外小麦品种(系)中有5个品种(系)含有Lr1，由于已较长时间大范围应用，导致病原物中相应的毒性基因频率上升，故Lr1对部分叶锈菌生理小种已失效[30]。若与合适的基因进行组合，也可发挥一定的抗病性，起到提高抗病能力的作用。50个国外小麦品种(系)中有5个品种(系)含有Lr26，目前Lr26已丧失抗性。13个品种(系)含有Lr34，11个品种(系)含有Lr37，45个品种(系)含有Lr46。Lr34、Lr37和Lr46在田间抗性都表现很好，尽管Lr37的显隐性也受到温度的影响，但一般表现为显性。一些研究表明，Lr34、Lr37基因组合在一起在田间表现出高于单基因表达出的抗性[31],并且研究表明当Lr34与Lr46组合在一起的抗病能力强于其中单基因产生的抗性，Lr34、Lr37和Lr46，在我国一直受到育种家们的青睐。本研究中，Aca801、Palpich、F92080g1-1/F93042g2-1、F98047j14-zinc、Mason/jagger、Tx03a0148、Hk1/6/Nvsr3/5bez/tvr、MV laura和MV05-08都同时携带Lr34和Lr46，且表现为高抗。供试材料中大多数品种(系)在成株期抗性良好，对于可能携带的未知抗叶锈病基因，还需进一步进行遗传分析和基因定位。

本研究采用基因推导和分子标记相结合的方法检测50个国外小麦品种(系)中所携带的抗叶锈病基因。基因推导在温室中进行，虽然避免了生长季节和环境等干扰因素的限制，但也会有弊端，例如受到小种鉴别力、遗传背景等因素影响，推导的结果会有局限性。分子标记能准确、快速且不受环境因素限制，但有时会受非特异性带型影响，显现假阳性，影响检测结果的准确性。本研究中选用的分子标记特异性强，并且检测结果与基因推导相一致，验证了本结果的可靠性。成株期微效抗病基因，通过成株期人工接种毒力强的混合叶锈菌小种鉴定。本研究中有19个小麦品种(系)在田间表现慢锈性，这对培育具有持久抗叶锈病基因的小麦意义重大。