不同方法提取肉豆蔻挥发油成分的气相色谱-质谱法分析

李力，潘倩雯，郭偲，周萌萌，肖俊勇，刘宏

(1.中国人民解放军中部战区总医院药剂科，武汉 430070；2.湖北中医药大学药学院硕士研究生班，武汉 430065；3.华中科技大学无限极现代制剂技术联合实验室，武汉 430075；4.国家纳米药物工程技术研究中心，武汉 430075)

肉豆蔻是肉豆蔻科常绿乔木肉豆蔻(Myristica fragrans Houtt.)的干燥种仁[1]。肉豆蔻种仁入药，可治虚泻冷痢、脘腹冷痛、呕吐等，亦有降血糖、降血脂、保肝、抗炎镇痛、抑菌、抗抑郁以及抗癌等作用[2]，肉豆蔻在传统的多种方剂中都有使用，例如复方二神丸[3]、四神丸[4]、肥儿丸[5]等。挥发油是肉豆蔻的主要生物活性成分[6]。目前关于研究报道中与肉豆蔻挥发油成分比较分析相关的主要有不同采收季节的肉豆蔻挥发油成分比较[7]、肉豆蔻叶和种仁挥发油气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)分析比较[8]和白豆蔻、红豆蔻、草豆蔻和肉豆蔻挥发油成分的比较[9]等。笔者尚未见文献报道关于多种提取方法所得肉豆蔻挥发油成分的比较分析。本研究是肉豆蔻挥发油谱效学系列研究中的一部分内容。为了获得在谱效学研究中足够多的差异化组成的样品，本研究采用了传统水蒸气蒸馏法、微波辅助水蒸气蒸馏法、超临界二氧化碳(CO2)流体萃取法和冷榨法提取肉豆蔻挥发油，并通过GC-MS联用技术检测分析肉豆蔻挥发油化学成分，比较不同方法提取肉豆蔻挥发油化学成分的差异，为后期肉豆蔻挥发油的谱效关系研究提供差异化样品的物质基础。

1 仪器与试药

1.1仪器 挥发油提取器(武汉民权化玻实验仪器有限公司)；WBFY-201微波化学反应器(上海恬恒仪器有限公司)；DF-101T集热式恒温磁力搅拌器(河南巩义予华仪器有限公司)；HA221-40-11-C型超临界萃取装置(上海亚荣生化仪器厂)；S120F科美特榨油机(常州市沃科特机械有限公司)；7890A-5975C气质联用仪(美国安捷伦科技有限公司)；HP-5MS气相毛细管色谱柱(美国安捷伦科技有限公司)。

1.2药品与试剂 肉豆蔻购自河北省安国市健仁药材有限公司，经海南兴隆热带药用植物园朱平主任鉴定为肉豆蔻科肉豆蔻干燥种仁。无水硫酸钠(国药集团化学试剂有限公司，含量≥99.0%，分析纯，批号：20160622)；氯化钠(国药集团化学试剂有限公司，含量≥99.5%，分析纯，批号：20161013)。

2 方法与结果

2.1传统水蒸气蒸馏法 称取粉碎粒径为0.250～0.425 mm肉豆蔻粉末50.00 g置于1000 mL圆底烧瓶，加入纯化水600 mL，放入沸石，振摇混合，连接挥发油测定器与回流冷凝管，浸泡1.5 h后开始加热，并保持微沸，提取6.0 h。挥发油用无水硫酸钠干燥，并用孔径0.22 μm滤膜过滤，供试样品待测。

2.2微波辅助水蒸气蒸馏法 称取粉碎粒径为0.250～0.425 mm的肉豆蔻粉末50.00 g置于500 mL圆底烧瓶，加入300 mL纯化水，放入沸石，振摇混合后置于微波化学反应器内，浸泡1.5 h，连接挥发油测定器与回流冷凝管。微波功率为390 W，微波时间为2.5 h。挥发油用无水硫酸钠干燥，并用孔径0.22 μm滤膜过滤，供试样品待测。

2.3超临界CO2流体萃取法 称取粉碎粒径为0.250～0.425 mm的肉豆蔻粉末300.00 g，采用超临界CO2流体萃取装置进行萃取。萃取压强为16 MPa，萃取温度为50 ℃，萃取时间为3.0 h，CO2流量为10 mL·min-1；分离釜Ⅰ：压强6 MPa，温度25 ℃；分离釜Ⅱ：压强5 MPa温度20 ℃。挥发油用无水硫酸钠干燥，并用0.22 μm滤膜过滤，供试样品待测。

2.4冷榨法 称取粉碎粒径为0.250～0.425 mm的肉豆蔻500.00 g，未经烘烤直接用科美特榨油机室温压榨制油，毛油经离心过滤除去杂质获得压榨油样品。挥发油用无水硫酸钠干燥，并用孔径0.22 μm滤膜过滤，供试样品待测。

2.5挥发油收率与提取时间 4种提取方法是在前期大量方法筛选的基础上建立的，鉴于篇幅所限仅报道出最终获得最优的提取方法。结果显示，超临界CO2流体萃取具有最高的挥发油收率和相对较短的提取时间，微波辅助水蒸气蒸馏提取法可显著缩短提取的时间，挥发油收率略低于单纯传统水蒸气蒸馏法，而传统水蒸气蒸馏法提取时间最长，提取效率相对较低。冷榨法因属于机械压榨法提取速度较快，但挥发油收率最低。所以综合比较而言，提取效率超临界CO2流体萃取>微波辅助水蒸气蒸馏>传统水蒸气蒸馏>冷榨法。见表1。

2.6GC-MS分析 顶空进样方法：称取肉豆蔻挥发油0.5 g，置于10 mL专用顶空瓶中，采用CTC PAL 自动进样器，80 ℃平衡15 min。气相色谱条件：HP-5MS石英毛细管柱(50 m×0.25 mm，0.25 μm)，进样口温度250 ℃，载气：氦气，载气流速1 mL·min-1，进样量500 μL，分流比50：1。程序升温：初始温度40 ℃(保持2 min)，6 ℃·min-1升温速率升至240 ℃(保持2 min)。质谱条件：离子源EI源，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，电子能量70 eV，倍增管电压：1.2 kV，接口温度280 ℃，质量范围50～550 u。传统水蒸气蒸馏提取肉豆蔻挥发油标为1号样品(S1)，微波辅助水蒸气蒸馏提取肉豆蔻挥发油标为2号样品(S2)，超临界CO2流体萃取肉豆蔻挥发油标为3号样品(S3)，冷榨法获得的肉豆蔻挥发油标为4号样品(S4)。按照上述条件进行实验，经化学工作站数据处理系统及用面积归一化法从其总离子流图中计算各组分的百分含量，所测的质谱图经计算机质谱数据库检索(质谱数据库NIST)，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)分析得GC-MS总离子流叠图(图1)。成分分析结果显示，传统水蒸气蒸馏提取肉豆蔻挥发油(1号样品)分离出36个色谱峰(相对百分含量为99.94%)，烷烯烃类化合物有20种、醇类化合物有8种、酚类化合物有2种、酯类化合物有1种、醚类化合物有4种、未鉴定的化合物有1种，其中β-松油烯(39.27%)含量最高，其余含量较高的成分为(1R)-(+)-α-蒎烯(20.72%)、β-蒎烯(11.25%)和双戊烯(7.52%)；微波辅助水蒸气蒸馏提取肉豆蔻挥发油(2号样品)分离出38个色谱峰(相对百分含量为99.96%)，烷烯烃类化合物有21种、醇类化合物有8种、酚类化合物有2种、酯类化合物有2种、醚类化合物有4种、未鉴定的化合物有1种，其中β-松油烯(47.76%)含量最高，其余含量较高的成分为(1R)-(+)-α-蒎烯(16.04%)、β-蒎烯(11.07%)和双戊烯(8.51%)。超临界CO2流体萃取肉豆蔻挥发油(3号样品)分离出35个色谱峰(相对百分含量为99.65%)，烷烯烃类化合物有15种、醇类化合物有8种、酚类化合物有1种、酯类化合物有1种、醚类化合物有5种、未鉴定的化合物有5种，其中(-)4-萜烯醇(21.41%)含量最高，含量较高的成分为顺式-β-松油醇(9.15%)，另外几种未鉴定。冷榨法压榨肉豆蔻挥发油(4号样品)分离出19个色谱峰(相对百分含量为99.92%)，烷烯烃类化合物有13种、醇类化合物有3种、醚类化合物有3种，其中β-松油烯(42.08%)含量最高，其余含量较高的成分为(1R)-(+)-α-蒎烯(25.13%)、β-蒎烯(12.23%)和双戊烯(5.66%)。见表2 。

表1 4种提取方法的提取时间和挥发油收率

Tab.1Extractiontimeandyieldofvolatileoiloffourextractionmethods

方法提取时间/h挥发油收率/[mL·(100 g)-1]传统水蒸气蒸馏6.05.23微波辅助水蒸气蒸馏2.54.53超临界CO2流体萃取3.06.78冷榨0.51.00

图1 肉豆蔻挥发油GC-MS总离子流色谱叠图

Fig.1OverlayoftotalionchromatogramofGC-MSfornutmegvolatileoil

3 讨论

本研究是肉豆蔻挥发油谱效学系列研究的基础研究部分。该系列研究包括差异化肉豆蔻挥发油的提取、肉豆蔻挥发油的抗炎镇痛作用药效评价及机制研究、差异化肉豆蔻挥发油样品抗炎镇痛作用的谱效相关性分析等内容。在本研究中，挥发油是肉豆蔻的主要生物活性成分，从文献报道来看，肉豆蔻挥发油具有降血糖、降血脂、保肝、抗炎镇痛、抑菌、抗抑郁以及抗癌等药理作用[10]。但这些药理作用后面的物质基础究竟是哪些药效物质群呢？即功效与成分之间是一种什么样的对应关系？这实际上也是中药现代化一直力求揭示的规律。而现在逐渐被大家所接受的中药谱效学研究则能较好地回答这个问题[11]，对肉豆蔻挥发油进行谱效学研究可筛选出药效最明确的药效物质群，并可在后期制剂开发中建立确保产品质量一致性的肉豆蔻挥发油的质量标准。为了从尽可能多的肉豆蔻挥发油成分中筛选出对应的活性成分，本研究采用了传统水蒸气蒸馏法、微波辅助水蒸气蒸馏法、超临界CO2流体萃取法和冷榨法4种肉豆蔻挥发油提取方法。通过GC-MS联用技术检测分析肉豆蔻挥发油化学成分，比较不同方法提取肉豆蔻挥发油化学成分的差异，为筛选出具有差异性的肉豆蔻挥发油提供依据。

2015年版《中华人民共和国药典》规定肉豆蔻挥发油收率不得低于6.0%(mL·g-1)。本研究中传统水蒸气蒸馏法提取肉豆蔻挥发油的收率为5.23%，可能与此批次肉豆蔻药材挥发油的实际含量达不到平均含量水平有关。因为肉豆蔻挥发油成分含量可因不同采收季节、不同的存放时间而不同。在本实验过程中由于采用的是同批次肉豆蔻药材，所以在这样的前提下可以比较出各方法的差异。另外，实验室水蒸气蒸馏过程中冷却效果不佳，挥发油来不及冷却从而使得挥发油挥发损失过多。

通过对4种不同方法提取肉豆蔻挥发油的成分进行对比分析可知，4种不同方法提取肉豆蔻挥发油中共有色谱峰有15个。4种方法提取肉豆蔻挥发油成分和含量均有不同程度的差异。传统水蒸气蒸馏法与微波辅助水蒸气蒸馏法两种方法所提取的肉豆蔻挥发油中组成成分种类基本一致，但在含量上存在一定差异。微波辅助提取法仅比传统蒸馏法多含有微量的乙酸香叶酯(0.01%)和反式-α-佛手柑油烯(0.01%)；但微波辅助提取的肉豆蔻挥发油中最主要的成分β-松油烯(47.76%)显著高于传统蒸馏法(39.27%)。与传统水蒸气蒸馏法和微波辅助水蒸气蒸馏法相比，冷榨法压榨所得肉豆蔻挥发油成分种类显著减少，含量稍有差异。传统水蒸气蒸馏法分离出36个色谱峰，微波辅助水蒸气蒸馏法分离出38个色谱峰，而冷榨法仅分离出19个色谱峰。超临界CO2流体萃取法主要成分种类和含量与另3种提取方法存在明显差异，其主要成分为(-)4-萜烯醇(21.41%)和顺式-β-松油醇(9.15%)，均为醇类且含量均比另3种方法高，而另3种提取方法主要成分均为烯烃类。

表2 4种不同方法提取肉豆蔻挥发油成分分析结果

传统水蒸气蒸馏法与微波辅助水蒸气蒸馏法均是通过加热回流来提取，其成分差异性可能与过程中加热温度不同相关，会造成低沸点成分不同程度的挥发损失和高沸点成分提取率的减少。冷榨法压榨肉豆蔻挥发油所含成分较少可能与施加压力相关。超临界CO2流体萃取肉豆蔻挥发油主要成分为醇类，可能与CO2流体溶解性能相关。此外，刘博等[12]研究发现超临界CO2流体萃取肉豆蔻挥发油中主要成分为肉豆蔻醚、桧烯和α-蒎烯等，亦有文献报道表明主要成分为柠檬烯、γ-松油烯和α-松油烯等[9]，而本实验中超临界CO2流体萃取肉豆蔻挥发油主要成分为醇类，可能与以下两点有关：超临界CO2流体萃取条件如萃取温度、萃取压力、萃取时间和CO2流量等；笔者采取顶空进样方法对肉豆蔻挥发油进行化学成分检测，这与文献报道中直接进样检测到的低沸点和高沸点成分种类和含量有差异。因此，课题组后期可通过调整超临界CO2流体萃取条件和GC-MS进样方式对肉豆蔻挥发油化学成分进行深入研究。通过4种不同方法提取获得的肉豆蔻挥发油含有未鉴定物，其中传统水蒸气蒸馏法、微波辅助水蒸气蒸馏法和超临界CO2流体萃取肉豆蔻挥发油3种提取方法含有的未鉴定物分别是1，1和5个，可在后期深入研究中进行分离和进一步进行结构确证。

本研究为后期课题组进行需求量较大的肉豆蔻挥发油谱效作用研究提供了基础，也可为新药开发中肉豆蔻挥发油作为新制剂的组方成分的研究提供一定的参考。