复方体外培育牛黄微乳凝胶的经皮渗透研究*

程璐，黄蕾，刘新国

(武汉市第一医院药学部，武汉 430022)

中医认为痤疮主要为热毒、瘀血所致，治疗原则应为清热解毒、活血祛瘀[1-3]。复方体外培育牛黄微乳凝胶由牛黄、丹皮酚和盐酸小檗碱等中药或中药有效成分组成，用于治疗痤疮，具有清热解毒、活血祛瘀、抗菌消炎的功效[4]。其中黄连、黄柏为清热解毒典型代表药，盐酸小檗碱为其共有有效成分，且具有较强的抗痤疮丙酸杆菌作用[5-6]。丹皮酚为具清热凉血、活血祛瘀功效的牡丹皮中有效成分，也具有较强的抗痤疮丙酸杆菌作用[7]。然而痤疮丙酸杆菌主要存在患者毛囊皮脂腺中[8]，不仅要求凝胶基质与皮肤组织有良好亲和性，更需要抗菌成分从基质逐步释放，透入皮肤深层产生作用，因此通过离体皮肤的渗透实验来评估复方体外培育牛黄微乳凝胶的皮肤渗透能力，筛选合适的制剂药物剂量水平，并考察各指标成分之间透皮行为的相互影响，可为新制剂开发奠定研究基础。

1 实验材料

1.1仪器 ME 215s型分析天平(赛多利斯公司，感量：0.01 mg)；Essentia LC-16型二元泵高效液相色谱仪(岛津公司)；RYJ-12B型药物透皮扩散实验仪(上海黄海药检仪器有限公司)；HS6510D型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2药品与试剂 丹皮酚对照品、盐酸小檗碱对照品(批号分别为0708-9704，0713-200911，均购自中国食品药品检定研究院)；复方体外培育牛黄微乳凝胶制剂(自制，批号：150901，150910，150922)；乙腈(色谱纯，美国TEDIA公司)，磷酸(分析纯，天津市白世化工有限公司)，其他试剂均为分析纯，水为纯化水。

1.3实验动物 健康成年雄性SD大鼠20只，华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK(鄂)2016-0001。饲养环境：屏蔽系统，室温(22±3) ℃，相对湿度(55±5)%。

2 方法与结果

2.1指标成分含量测定方法

2.1.1色谱条件 色谱柱：Diamonsil柱(250 mm×4.60 mm，5 μm)，流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸(B)(0～7 min，35%A→45%A；7～13 min，45%A→55%A；13～15 min，55%A→35%A)，流速1.0 mL·min-1，柱温30 ℃，检测波长为265 nm，进样量10 μL。

2.1.2对照品贮备溶液 精密称取减压干燥至恒重的盐酸小檗碱和丹皮酚对照品适量，加甲醇分别制成浓度均为500 μg·mL-1对照品贮备溶液。

2.1.3线性关系的考察 精密吸取上述两种对照品贮备溶液100，200 μL和1，2，4，8 mL，用甲醇稀释定容至10 mL，精密吸取10 μL注入液相色谱仪，按照上述色谱条件进行测定。以峰面积积分值为横坐标(X)，以进样量(ng)为纵坐标(Y)，进行线性回归计算，结果盐酸小檗碱在50 ng～4 μg浓度范围内线性关系良好，回归方程为Y=0.341×10-2X+2.3644，r=1.000 0；丹皮酚在50 ng～4 μg浓度范围内线性关系良好，回归方程：Y=0.311 5×10-4X+5.292 6，r=0.999 9。

2.1.4精密度实验 精密吸取同一供试品溶液10 μL，重复进样6次，分别测定指标峰峰面积，盐酸小檗碱和丹皮酚峰面积RSD值分别为1.2%和0.48%，表明仪器精密度良好。

2.1.5稳定性实验 精密吸取同一供试品溶液10 μL，分别于0，2，6，12，24 h进样，测定两个指标峰的峰面积，经计算盐酸小檗碱和丹皮酚峰面积RSD值分别为0.31%和0.37%，表明供试品溶液在24 h内保持稳定。

2.1.6回收率实验 分别向已知含量的渗透液样品中加入一定量盐酸小檗碱和丹皮酚对照品溶液，用流动相定容至10 mL，混匀，精密吸取10 μL注入液相色谱仪，测定峰面积，利用标准曲线计算含量，并计算加样回收率。结果盐酸小檗碱和丹皮酚平均加样回收率分别为98.13%和98.65%，RSD分别为0.80%和0.50%。见表1。

表1 盐酸小檗碱和丹皮酚加样回收率计算结果

Tab.1Resultsofrecoverytestonberberinehydrochlorideandpaeonol

称样量/g原有量加入量测得量μg回收率/%盐酸小檗碱5.245 6204.7103.6304.996.725.218 6203.7103.6305.898.555.262 4205.4207.2408.397.925.225 8204.0207.2409.198.985.269 1205.7310.8511.798.465.236 4204.4310.8509.598.17丹皮酚2.524 9342.3206.8546.698.792.091 8343.4206.8545.797.822.245 6342.4310.2648.198.542.267 3352.0310.2654.397.452.256 4342.5620.4958.599.292.315 8330.0620.4946.398.34

2.2不同体外牛黄浓度复方微乳凝胶经皮渗透实验

2.2.1实验皮肤的制备 雄性SD大鼠20只，8%BaS腹部脱毛，饲养24 h，处死后取下腹部皮肤，仔细剥离皮下脂肪组织，并用0.9%氯化钠溶液冲洗至无浑浊为止。处理好的皮肤可用铝箔包裹，置于-20 ℃低温冰箱中保存，备用。

2.2.2试药制备 精密称取处方量丹皮酚、桉油精，山梨醇甘油酸酯和聚山梨醇-80，45 ℃水浴加热溶于液体石蜡中，搅拌均匀为油相。另称取处方量盐酸小檗碱溶于热水中，搅拌均匀为水相，在45 ℃水浴加热条件下，将水相慢慢加入油相，同时磁力搅拌，制成初乳，将初乳在超声功率450 W，超声时间与间歇时间比为2：1，超声总时间为5 min的条件下进行超声乳化，备用。称取卡波姆940撒入适量双蒸水中，静置过夜，待其溶胀均匀后加入处方量甘油和适量三乙醇胺，搅匀。取制备好的乳剂5 g，加入体外培育牛黄(微粉至筛孔内径0.0750 mm)1 g，研匀，加入适量空白凝胶基质中，搅匀。防腐剂山梨酸钾用适量纯化水溶解，用量为2.0‰，加入上述制备好的凝胶中，加纯化水定量至100 g，即得。按上述方法另制备含量分别为处方量20%，50%，75%，200% 4种不同药物浓度的微乳凝胶以及盐酸小檗碱、丹皮酚单一成分微乳凝胶[7]。

2.2.3经皮渗透实验方法 取预处理的鼠皮，将不同药物浓度复方体外培育牛黄微乳凝胶分别均匀涂抹于离体鼠皮角质层一侧，用改良的Franz扩散池(池口面积为2.8 cm2，体积6.5 mL)的两个半池将皮肤夹紧，角质层面向上，将多余的皮肤剪去，固定装置。将20%乙醇和0.9%氯化钠溶液加入接收池，液面与皮肤内层接触，保证无气泡存在。开动电磁搅拌器恒速搅拌(200 r·min-1)和恒温水浴(32±1) ℃。另取一套Franz装置，同法操作，将不含药物的空白基质紧贴于离体鼠皮角质层一侧，作为空白对照。分别于规定时间取样5 mL，再立即补充相同温度5 mL接收液。接收液用孔径0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液供HPLC测定。对照品溶液、样品溶液、空白基质液进样检测的HPLC色谱图，结果表明空白基质及皮肤不干扰测定。

在测定的峰面积标准曲线上求出相应的药物浓度，计算累积渗透量[Q，μg·(cm2)-1]，拟合Q～t经时变化曲线，结果见图1。

以Q～t作线性回归，直线的斜率即为透皮速率[J，μg·(cm2·h)-1]，将稳态直线推至时间轴，得渗透时滞tlag(h)。

式中，Cn：第n个取样点测得的药物浓度(μg·mL-1)；Ci：第i(i=n-1)个取样点测得的药物浓度(μg·mL-1)；A：有效扩散面积。

对累积释药量Q[μg·(cm2)-1]进行零级、一级和Higuchi动力学方程拟合，得下列方程见表2。结果显示，在考察药物浓度范围复方体外培育牛黄微乳凝胶中盐酸小檗碱成分经皮渗透参数均以零级动力学方程拟合为优，表明该成分透过皮肤是一个被动扩散过程，单位时间透皮量与基质药物浓度呈正比，且Q-t关系可用Ficks扩散定律来描述。而丹皮酚成分经皮渗透参数则均以Higuchi动力学方程拟合为优，表明在此浓度范围内丹皮酚从凝胶基质骨架中释放量遵循单位面积释放量与时间的平方根成正比的规律，基质药物浓度增加与单位时间透皮量提高不呈比例。见表2。

A.接收液中盐酸小檗碱；B.接收液中丹皮酚

Fig.1Time-dependentcurveofaccumulatedtransdermalpermeationstudyoncompoundcultivatedcalculusbovismicroemulsiongelinvitroatdifferentconcentration

2.3单一成分与复方成分透皮行为的比较 为考察复方体外培育牛黄微乳凝胶中成分单用与合用对透皮行为的影响，制备盐酸小檗碱、丹皮酚单一成分微乳凝胶，并按照“2.2.3”项下方法进行透皮实验，每种药物平行操作6次，并对接收液中盐酸小檗碱和丹皮酚含量进行测定。结果显示，盐酸小檗碱单一成分制剂16 h内累积透皮量显著大于复方制剂(P<0.05)，而丹皮酚单一成分制剂与复方制剂在考察时间内累积透皮量差异较小，这说明复方体外培育牛黄微乳凝胶中可能存在影响盐酸小檗碱释放或透皮的不利因素，还需要深入研究，找出原因并加以克服。见图2，表3。

表2 复方体外培育牛黄微乳凝胶中盐酸小檗碱和丹皮酚经皮渗透动力学参数

Tab.2Transdermalpermeationparametersofberberinehydrochlorideandpaeonolincompoundcultivatedcalculusbovismicroemulsiongelinvitron=6

名称与方程类型盐酸小檗碱透皮量-时间拟合方程相关度透皮速率/[μg·(cm2)-1·h-1]时滞时间/h丹皮酚透皮量-时间拟合方程相关度透皮速率/[μg·(cm2)-1·h-1]时滞时间/h25%药物浓度 ZeroQ=23.10t-4.4960.991 223.100.19Q=6.45t+15.770.972 96.45- FirstlnQ=0.274 9t+2.479 20.822 40.2749-lnQ=0.183 3t+2.4830.719 30.183 3- HiguchiQ=93.48t1/2-66.660.949 693.480.71Q=27.93t1/2-5.3500.996 927.930.1950%药物浓度 ZeroQ=36.58t-9.9610.988 436.580.27Q=7.99t+17.140.974 47.99- FirstlnQ=0.284 2t+2.828 80.802 70.284 2-lnQ=0.193 2t+2.565 20.724 10.193 2- HiguchiQ=147.25t1/2-106.740.941 7147.250.72Q=34.41t1/2-8.6760.993 934.410.2575%药物浓度 ZeroQ=56.31t-15.560.986 456.310.27Q=9.37t+17.5360.979 79.37- FirstlnQ=0.298 3t+3.115 30.788 20.298 3-lnQ=0.201 0t+2.618 30.730 00.201- HiguchiQ=227.28t1/2-165.810.942 4227.280.72Q=40.12t1/2-12.2150.992 740.120.30100%药物浓度 ZeroQ=65.28t-20.940.994 565.280.32Q=9.75t+16.0490.983 79.75- FirstlnQ=0.308 8t+3.152 50.791 80.308 8-lnQ=0.203 4t+2.607 00.737 60.203 4- HiguchiQ=263.52t1/2 -195.210.950 3263.520.74Q=41.414t1/2-14.2110.988 641.4140.34200%药物浓度 ZeroQ=110.16t-53.270.988 5110.160.48Q=14.69t+20.310.983 414.69- FirstlnQ=0.318 3t+3.545 50.774 00.318 3-lnQ=0.220 9t+2.809 90.735 70.220 9- HiguchiQ=439.44t1/2 -336.480.933 4439.440.76Q=62.25t1/2-25.0270.986 762.250.40

A.接收液中盐酸小檗碱；B.接收液中丹皮酚

Fig.2Time-dependentcurveofaccumulatedtransdermalpermeationstudyonberberinehydrochlorideandpaeonolascompoundorsinglecomponent

表3 复方和单一成分盐酸小檗碱与丹皮酚的经皮渗透动力学参数

Tab.3Transdermalpermeationparametersofberberinehydrochlorideandpaeonolascompoundorsinglecomponentn=6

对象与方程类型透皮量-时间拟合方程相关度透皮速率/[μg·(cm2)-1·h-1]时滞时间/h盐酸小檗碱(单一成分) ZeroQ=109.38t+71.5920.992 6109.38- FirstlnQ=0.290 0t+4.106 40.798 60.29- HiguchiQ=455.12t1/2-248.550.941 9455.120.55盐酸小檗碱(复方) ZeroQ=59.70t-26.0490.978 059.700.43 FirstlnQ=0.304 6t+3.081 20.716 90.30- HiguchiQ=239.33t1/2 -181.970.994 5239.330.76丹皮酚(单一成分) ZeroQ=9.987t+20.4460.988 39.987- FirstlnQ=0.200 4t+2.706 50.749 90.20- HiguchiQ=42.903t1/2-11.5680.982 242.9030.27丹皮酚(复方) ZeroQ=11.52t+14.4820.988 311.52- FirstlnQ=0.213 3t+2.626 10.749 90.21- HiguchiQ=48.361t1/2-20.1270.982 248.3610.42

3 讨论

由于细菌感染与炎症反应是痤疮发病的两个主要因素，将具清热解毒、活血化瘀功能且具有抗菌活性和(或)抗炎活性的中药和(或)其有效成分，组成复方制剂，其目的是为了既抗炎又抗菌，起协同作用，从理论上讲疗效应比单纯应用某一种好，而且诱导耐药性的可能性极小[9]。将选定的中药或中药有效成分物组成不同处方和(或)比例，切合现代医学的发病机制，通过体外模拟实验多角度证实有效成分透皮性能，探讨透皮过程成分间相互影响，并筛选合适的基质药物浓度，为探究新剂型经皮渗透特征、临床使用和优化处方组成提供实验依据。