膀胱癌中环状RNA相关研究的新进展

万邦贝 综述，吕 蔡 审校

(中南大学湘雅医学院附属海口医院泌尿外科，海南海口 570208)

膀胱癌(bladder cancer，BC)是全世界最常见的十大恶性肿瘤之一，在2018年的一份研究报告显示全世界每年约有54.9万新发病例和20万的死亡人数，男性的发病率(9.6/10万)和死亡率(3.2/10万)是女性的4倍，且发病率和死亡率仍在攀升[1]。因此，探寻膀胱癌的特异性诊断生物标志物、靶向治疗和预测预后的生物标志物将更加迫切。环状RNA(circular RNA，circRNA)是一类特殊的非编码RNA，其表达失调与癌症发生、发展密切相关[2-4]。研究表明circRNA表达失调在膀胱癌的发生以及发展等不同病理过程发挥着重要的抑癌或促癌作用，影响膀胱癌的生长以及膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭，但它的切确作用机制尚未完全简明[5-6]。现就circ RNA在膀胱癌中的新近研究进展作一综述。

1 circRNA的概述

环状RNA(circular RNA，circRNA)，也是一类非编码RNA，其形成与基因组所有区域的“套索循环”或“重新剪接”有关。circRNA大部分来自基因的外显子，但也有少部分来自基因间或内含子区以及反义和非翻译区。circRNA的形成受以下因素的影响，包括内含子长度、外显子长度、重复序列、RNA结合蛋白(包括Quaking、腺苷脱氨酶)等[7]。circRNA可存在于亚细胞区室，但多数在细胞质中，与其他非编码RNA不同，circRNA不含5′、3′末端和多聚腺苷酸尾而呈封闭的环状结构，因此更能抵抗RNA外切酶的作用，表达更稳定，不易被降解，并在真核细胞中广泛表达[8-11]。早在1979年，cicrRNA就被发现在人类身体中，但由于当时科技水平的限制和缺乏确切生物化学证据，一直没有明确的定义[12]。直到2012年国外学者利用转录组测序技术(RNA-seq技术)和生化分析首次证实了人类基因的转录本中有一部分是环状RNA，并对它进行进一步的研究才有了突破性的进展[13]。

近年很多研究表明circRNA主要具有以下作用机制：①circRNA分子富含miRNA结合位点，能与miRNA直接结合，作为miRNA分子海绵，阻止miRNA结合到靶基因的3′端非翻译区，从而解除miRNA对其靶基因的作用，上调或下调靶基因的表达水平，这一作用机制被称为竞争性内源RNA(ceRNA)机制(图1)[14-15]；②circRNA通过减少线性剪接，从而调节基因的表达[16]；③circRNA可作为一个转录调节者，与RNA结合蛋白结合并影响基因的转录[17-18]；④circRNA可作为mRNA信使，通过选择性剪切从成熟的mRNA剪除起始密码子，从而减少癌症中蛋白质的生成[19]；⑤circRNA还可与其他蛋白质结合(如muscleblind蛋白)影响其他circRNA和蛋白质的动态表达[20]。

图1 circRNA作为miRNA分子海绵作用机制

作为miRNA海绵间接调控基因表达是circRNA最常见的作用机制，其正是通过这一作用机制在多种疾病(如肝癌[21]、肺癌[22]、胃癌[23]、糖尿病肾病[24]等)中起重要的调控作用。

2 circRNA与膀胱癌

根据circRNA在膀胱癌中作用机制的差异，可将其分为抑癌circRNA及促癌circRNA，而竞争性内源RNA(ceRNA)机制是膀胱癌中circRNA相关作用研究的热点[25]，其作为miRNA海绵调控下游靶基因的表达，从而发挥抑制或促进膀胱癌发生发展的作用(图1)。膀胱癌中相关circRNA研究总结见表1。

2.1 抑癌cicrRNA抑癌circRNA的研究将为膀胱癌的诊断、治疗、预测预后提供新方向。在膀胱癌中circRNA可作为miRNA海绵间接下调靶基因表达，从而发挥抑癌作用(图1)。有学者通过RNA-seq数据库分析发现HIPK3在膀胱癌中表达失调，利用RT-PCR检测发现HIPK3在44例膀胱癌组织及细胞系(T24T、UMUC3)表达明显下调，并且与膀胱癌分级、浸润和淋巴结转移呈负相关，过表达HIPK3则可抑制膀胱癌细胞的迁移及侵袭，进一步实验证实HIPK3与miR-558存在两个关键结合位点，HIPK3的过表达可以作为miR-558的ceRNA抑制HPSE、VEGF、MMP9的表达从而抑制膀胱癌的进展[26]。BCRC4也是具有抑癌作用的circRNA分子之一，过表达BCRC4可以抑制膀胱癌细胞的活力并促进癌细胞的凋亡，其作用机制是BCRC4通过上调miR-101并抑制EZH2的表达来促进膀胱癌细胞凋亡的，而药物实验证实藤黄酸(gambogic acid，GA)诱导膀胱癌细胞的凋亡正是通过提高BCRC4表达和抑制EZH2表达来实现的[27]。

circRNA还可作为miRNA海绵上调靶基因的表达，从而抑制膀胱癌的进展。ITCH作为多种肿瘤抑制因子，有研究者通过qRT-PCR技术检测72对膀胱癌患者组织发现，ITCH在膀胱癌组织中低表达并且与患者预后更差相关，ITCH过表达可抑制膀胱癌细胞的迁移和侵袭并诱导细胞凋亡及G1/S期细胞周期阻滞，深入研究证实ITCH可作为miR-17和miR-224的分子海绵来上调它们的靶基因p21和PTEN的表达从而实现对膀胱癌侵袭性生物学行为的抑制[28]。miR-182-5p是具有促癌作用的miRNA，而BCRC-3是一个较新的抑癌circRNA，有研究报道BCRC-3的过表达可以抑制膀胱癌细胞增殖以及诱导G0/G1期细胞周期阻滞和抑制肿瘤的生长，BCRC-3的抑癌作用正是作为miR-182-5p的ceRNA，上调p27的表达来实现的。另外，对茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MJ)的抗癌作用研究发现，其抑癌作用也是通过BCRC-3-miR-182-5p-p27通路来上调p27基因的表达执行的[29]。此外，LIU等[30]发现UBXN7也是较新的抑癌circRNA，UBXN7表达量与膀胱癌患者的病理分期、分级呈负相关，与预后呈正相关，体外实验证实UBXN7的过表达可以抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移及侵袭，而沉默UBXN7的表达则可增强癌细胞的生存以及增殖能力，体内实验也证实了UBXN7的过表达可以抑制肿瘤的生长，UBXN7的抑癌机制是通过与直接结合miR-1247-3p，从而上调B4GALT3基因的表达来实现的。综上所述，circRNA可作为预测膀胱癌患者预后的生物标志物，此外，如何提高膀胱癌中抑癌circRNA的表达或者激活其下游通路可能成为未来靶向治疗膀胱癌的新方向。

2.2 促癌circRNAcicrRNA除了具有类抑癌基因作用外还具有癌基因作用，了解circRNA影响膀胱癌的发生和转移机制，将为膀胱癌的治疗提供一个新方向。很多研究发现其促癌作用也是通过作为miRNA海绵上调或下调靶基因的表达来执行的(图1)。MYLK是具有促癌作用的circRNA分子，研究发现MYLK和VEGFA在膀胱癌组织中均表达升高，过表达MYLK可以增强CD31、S100A4、VEGFA、snail、N-cadherin、vimentin、Ras、p-RAF-1、p-MEK1/2、pERK1/2表达并抑制E-cadherin、ZO-1表达，因此认为MYLK促进异体膀胱肿瘤的生长及转移可能是通过VEGFA调节血管生成以及促进上皮间质转化过程和激活Ras/ERK1/2通路来进行的，进一步研究证实了MYLK是作为miR-29a的ceRNA，解除miR-29a对VEGFA调节血管生成、上皮间质转化、Ras/ERK1/2通路的抑制作用从而促进膀胱癌的进展[31]。PTK2也是具有促癌作用的circRNA，有研究者通过检测患者的膀胱癌组织以及手术前后血液中PTK2的表达，发现PTK2在膀胱癌组织中表达较癌旁正常组织高，术前血液PTK2表达较术后高，并且PTK2表达水平与肿瘤分化、淋巴结转移及肿瘤分期明显相关，通过体外细胞实验及体内动物实验证实，过表达PTK2可以促进膀胱癌细胞的增殖及迁移和膀胱肿瘤的生长及淋巴结转移，但研究者并未对其促癌分子机制进行深入探讨[5]。

circRNA直接结合miRNA从而上调靶基因的表达并发挥促癌作用，仍然是研究的主流。ZHONG等[32]通过生信分析发现多种circRNA在膀胱癌中表达失调，qRT-PCR检测40对样本证实FAM169A、TRIM24在膀胱癌组织中表达下调，而TCF25、ZFR、PTK2、BC048201则表达明显上调，进一步对TCF25调节膀胱癌进展通路预测发现，在体内或体外TCF25可下调miR-103a-3p和miR-107的表达并增加CDK6的表达来促进膀胱癌细胞的增殖和迁移。BPTF是从BPTF基因外显子中转录出来的一种新促癌circRNA，其与膀胱癌患者的肿瘤分级、复发、预后差明显相关，通过对它的功能及分子机制研究发现，BPTF与miR-31-5p存在结合位点，BPTF可减弱miR-31-5p的功能并增强RAB27A(miR-31-5p的靶基因)表达和膀胱肿瘤细胞增殖，但这种作用可被miR-31-5p模拟物所逆转，因此认为BPTF是通过miR-31-5p/RAB27A通路来发挥促癌作用[33]，BPTF及其相关通路可作为治疗的靶向和预测膀胱癌预后的标志物。另外，WU等[34]研究发现CEP128也是一种促癌circRNA，miR-145-5p是一种重要的抑癌分子，通过生信分析发现CEP128可能是miR-145-5p的ceRNA，进一步实验证实了CEP128可减弱miR-145-5p的作用，其作为miR-145-5p的分子海绵直接上调SOX11来促进膀胱癌细胞的增殖，而沉默CEP128的表达则可抑制膀胱癌细胞的增殖并促进凋亡。因此，对circRNA促癌通路的研究可能将成为未来治疗膀胱癌的新靶标。

另外，新近报道膀胱癌中的促癌circRNA还有circ-0000144/miR-217/RUNX2[35]、UVRAG/miR-223/FGFR2[36]、VANGL1/miR-605-3p/VANGl1[37]等。膀胱癌中相关circRNA功能见表1。

表1 膀胱癌中相关circRNA总结

CircRNA miRNA 下游靶基因功 能参考文献HIPK3miR-558HPSE、VEGF、MMP9抑制癌细胞迁移、侵袭、血管新生、肿瘤的生长和 转移[26]BCRC4miR-101EZH2抑制癌细胞增殖并诱导凋亡[27]ITCHmiR-17、miR-224p21、PTEN抑制癌细胞迁移、侵袭,诱导凋亡及G1/S期阻滞[28]BCRC-3miR-182-5pp27抑制癌细胞增殖,诱导G0/G1期阻滞[29]UBXN7miR-1247-3pB4GALT3抑制癌细胞增殖、迁移、侵袭,诱导G0/G1期阻滞[30]MYLKmiR-29aVEGFA促进癌细胞增殖、迁移、侵袭以及肿瘤生长、转 移、上皮间质转化,抑制凋亡[31]PTK2--促进癌细胞增殖、迁移以及肿瘤生长、淋巴结转移[5]TCF25miR-103a-3p、miR-107CDK6促进癌细胞增殖、迁移[32]BPTFmiR-31-5pRAB27A促进癌细胞侵袭、迁移以及肿瘤生长[33]CEP128miR-145-5pSOX11促进癌细胞增殖并抑制凋亡[34]circ-0000144miR-217RUNX2促进癌细胞增殖、迁移、侵袭以及肿瘤生长[35]UVRAGmiR-223FGFR2促进癌细胞增殖、迁移以及肿瘤生长[36]VANGL1miR-605-3pvangl1促进癌细胞增殖、迁移以及肿瘤生长[37]

3 小结与展望

目前，circRNA种类繁多且功能复杂，尚未完全研究透彻，多数研究发现circRNA在癌症中的作用主要是作为miRNA的ceRNA来破坏miRNA对靶基因的抑制作用，从而发挥其抑癌或促癌作用，而对circRNA通过其他通路及分子机制影响癌症的发生、发展研究仍然较少，仍有待进一步深入探索。因此，如何实现对促癌circRNA的抑制以及提高抑癌cicrRNA的表达可能是未来治疗膀胱癌的一个新靶向，从而实现对膀胱癌患者的个体化治疗，造福更多的膀胱癌患者。