电子舌联合微生物测序技术分析贮运温度对巴氏杀菌乳品质的影响

丁瑞雪，耿丽娟，刘丽云，洛 雪，史海粟，武俊瑞,*

（1.沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866；2.沈阳市食品检验所，辽宁 沈阳 110136；3.蒙牛乳业（沈阳）有限责任公司，辽宁 沈阳 110100）

巴氏杀菌乳是通过低温杀菌的一种乳品，这种杀菌方法最大限度的保留了原料乳中固有的营养成分及风味[1-2]。因此在国内外迅速地发展起来，得到了消费者的认可[3-6]。巴氏杀菌乳的气味和味道是评价其品质的重要手段。电子舌是近年来研究的热门话题，与传统的化学分析方法相比，区别在于传感器输出不是样品成分的分析结果，而是与样品某些特征相关的信号模式，这些信号可以通过具有模式识别能力的计算机分析获得，然后整体评估样品的味道特征[7-10]。电子舌的应用避免了人为感官鉴评中产生客观因素的影响，利用不同的滋味传感器能更加准确地评估乳制品不同滋味的感官评分。Toko等[11]将电子舌技术应用于牛奶分析，利用主成分分析、偏最小二乘回归模型等分析方法验证了电子舌可以很好地区别不同热处理工艺、不同贮藏时间、温度下的牛乳[12-14]。现如今，已经有很多实验尝试使用电子舌分析乳制品，包括味道、风味、新鲜度、微生物生长监测等评估[15-17]。这为现代乳品企业和相关监管机构提供了新的研究思路和有效手段[18-20]。

由于巴氏杀菌乳杀菌温度较低，冷链温度并不总是保持在推荐范围内，由此增加了食品在储存过程中变质和潜在致病性微生物生长的风险[21-22]。因而不能杀死鲜乳中全部的微生物和酶，依然存在致病菌等未消灭的菌株[23]。Ławniczaka等[24]在巴氏杀菌乳门店冰箱冷藏贮存售卖期间的温度及品质变化的研究中一般都采用传统的纯培养方式探究贮藏条件下巴氏杀菌乳微生物的变化情况。然而，随着高通量测序技术在乳品生态位中的大量应用，特别是那些基于16S rRNA细菌种类分类和培养独立技术的工具，使得对整个微生物生态系统的评估更加精确[25-26]，这为探索乳制品中复杂的微生物世界提供了条件。本实验采用高通量测序技术测定了不同贮藏条件下巴氏杀菌乳微生物多样性的变化，同时结合电子舌味感指标更精准分析、评价微生物的物种变化情况，以期为今后的研究提供更加系统的评价依据。

1 材料与方法

1.1 材料

采集GZ、CG、HS三家乳业正常工艺当天生产的巴氏杀菌乳制品样品，置于冰盒中，运回实验室。将采集的3 家巴氏杀菌乳混合均匀，分别置于0、4、10、15、25 ℃恒温箱中进行贮藏，并分别于0、3、6、9、12、15 d进行取样，备用进行后续实验。

1.2 仪器与设备

InsentSA402B电子舌 日本Insent公司；YCDEL259医用冷藏冷冻箱 中科美菱低温科技股份有限公司；HN-50S电热恒温培养箱 邦西仪器科技（上海）有限公司；MIR-254-PC低温恒温培养箱 日本松下健康医疗器械公司；Axy Prep DNA凝胶回收试剂盒AXYGEN公司；TGL-168高速台式离心机、超低温冰箱、微量紫外-分光光度计聚合酶链式反应扩增仪德国Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 乳业的工艺条件

GZ乳业的工艺条件：原奶验收→净乳→预巴杀→冷藏→定容检验→预热均质→巴氏杀菌→冷藏罐装→成品。

CG乳业的工艺条件：原奶验收→净乳→均质→巴氏杀菌→降温罐装→成品。

HS乳业的工艺条件：原料乳的验收→过滤与净化→标准化→均质→巴氏杀菌→冷却灌装→成品。

1.3.2 感官评价

根据RHB 101—2004《巴氏杀菌乳感官质量评鉴细则》[27]中巴氏杀菌乳的感官质量评鉴细则，选用20 位以乳制品专业为基础，经过感官分析培训的女性评审员（29～59 岁）[28]进行对于巴氏杀菌乳的滋气味、组织状态和色泽进行感官评鉴。用于感官评鉴的牛奶样品在环境温度20 ℃统一呈送[28]，每种样品的各个参数重复品评2 次，结果取平均值，作为判定结果。

1.3.3 电子舌检测及味感测定方法

电子舌的检测参数为：最大电位1.00 V、最小电位-1.00 V、点位步进0.2 V、电极灵敏度0.000 1。取适量体积的巴氏杀菌乳于专用小杯中，电子舌的传感器在各个样品中的采集测量30 s，清洁330 s。每种样品测量5 次。电子舌利用电化学传感器通过测定液体样本的综合味觉信息，从而对被测试样进行定量和定性分析。

1.3.4 巴氏杀菌乳中细菌种类的测定方法

取不同贮藏条件下的样品10 mL放入离心管中，离心后去除乳脂层，再次离心后收集沉淀按照DNA试剂盒要求进行提取并利用16S rRNA聚合酶链式反应扩增，本实验中的每个样本扩增3 份，按物质的量比例混合后在MiSeq测序平台进行测序。

1.4 数据分析方法

1.4.1 感官评价的数据分析方法

绘制雷达图，分析比较巴氏杀菌乳在不同贮藏条件下的感官特性。评价特性及指标见表1。

表1 巴氏杀菌乳感官评分[27]Table 1 Criteria for sensory evaluation of pasteurized milk

1.4.2 电子鼻和电子舌的数据分析方法

利用电子舌对不同贮藏条件下的各样品进行酸、苦、涩、甜、咸和鲜6 个值的测试，并且各样品平行测定3 次，绘制雷达图用于主成分分析。

1.4.3 巴氏杀菌乳中细菌种类的分析方法

在97%的相似性水平上归类和确定分类单位数量，同时结合电子舌检测结果确定巴氏杀菌乳在不同贮藏条件下的细菌种类变化情况。使用QIIME（quantitative insights into microbial ecology）软件去除低质量序列，做成热图，再进行生物信息学分析。

2 结果与分析

2.1 感官评价分析

图1为巴氏杀菌乳样品感官特性的描述性检验得分雷达图。分析不同贮藏条件下巴氏杀菌乳滋气味、组织状态、色泽评分的变化。

图1 不同贮藏条件下巴氏杀菌乳感官特性雷达图Fig. 1 Radar diagram of sensory characteristics of pasteurized milk under different storage conditions

由图1可知，随着贮藏温度升高、时间延长，巴氏杀菌乳滋气味的评分呈趋势性的下降。巴氏杀菌乳在0、4、10 ℃贮藏时其滋气味评分下降缓慢，在3 d内都能保持有乳香味。而巴氏杀菌乳的组织状态同样在0、4、10 ℃贮藏下时无明显下降趋势，证明此温度下无沉淀和脂肪分离的情况。而从15 ℃开始，随着贮藏时间的延长，下降趋势愈加显著。相同的，巴氏杀菌乳在低温贮藏条件下普遍呈现乳白色，随着温度的升高，逐步达到黄褐色，此变化或许与其出现黏稠的组织状态有关。

2.2 电子舌评价分析

由图2可知，不同贮藏温度、时间下的巴氏杀菌乳的各个味感值有明显的变化。0 ℃贮藏不同时间各味感变化最为明显。而巴氏杀菌乳在其他贮藏温度条件下，随着贮藏温度升高和、时间的延长，鲜味及苦味值发生略微的下降，而其涩味值则有轻微的上升现象。巴氏杀菌乳在贮藏过程中其特有的香甜味是主要变化指标，因此，巴氏杀菌乳在15、25 ℃条件贮藏后都会导致甜味的显著下降。而随着贮藏温度及时间的增加，可能微生物的生长也导致了巴氏杀菌乳的发酵腐败，使其酸味值显著上升。

图2 贮藏在0（A）、4（B）、10（C）、15（D）、25 ℃（E）巴氏杀菌乳电子舌雷达图Fig. 2 Radar maps of electronic tongue responses to pasteurized milk samples stored at 0 (A), 4 (B), 10 (C), 15 (D) and 25 ℃ (E)

2.3 巴氏杀菌乳电子舌味感与细菌多样性主成分分析

图3 巴氏杀菌乳电子舌味感与其属水平上细菌多样性主成分分析Fig. 3 Principal component analysis of electronic tongue taste and bacterial diversity of pasteurized milk

如图3可知，图中主成分1、主成分2保留了78.73%的原始数据信息。以上不同颜色标记是基于不同温度划分的5 组组分，两样本点越接近，表明两样本物种组成越相似。不同样品之间微生物多样性的差异可以通过图中各样本点的距离表征，两样本点相聚越近证明其微生物多样性越相似。同时，电子舌味感的数量型会被显示成向量，样本点到数量型电子舌味感向量的投影距离表示样本受该环境因子影响大小。研究发现，属水平上的各样品到向量1酸味、向量2涩味味感投影距离接近于0或为负值。这表明巴氏杀菌乳样品中的微生物组成与酸、涩两种味感的相关性较小。而其他样品到向量3苦味、向量4咸味、向量5鲜味、向量6甜味味感的投影距离大多为正值，因此猜测其与乳中细菌多样性密切相关。相关研究也表明，某些微生物属水平物种皆对苦味呈现着显著的正相关性[29]。同时，Wei Zhenbo等[30]研究也发现，在贮藏过程中，牛奶样品的理化性质在主成分分析图中也表现出类似的规律性。

2.4 巴氏杀菌乳电子舌味感与细菌多样性相关性热图分析

如图4所示，巴氏杀菌乳电子舌味感与细菌多样性密切相关。研究发现，各细菌菌属对鲜味味感的影响最小，气单胞菌属（Aeromonas）、阪崎肠杆菌（Cronobacter）、沙雷氏菌（Serratia）、梭状芽孢杆菌（Costridium）甚至与其呈现负相关性。同样的，上述物种菌属也都对巴氏杀菌乳的苦味、咸味、甜味有着负相关性。有研究表明，某些孢子形成细菌在冷藏条件下生长，会导致蛋白水解酶对牛奶种的主要成分进行分解，从而影响其感官质量[29]。并且，除气单胞菌属、梭状芽孢杆菌、沙雷氏菌、类芽孢杆菌（Paenibacillus）、假单胞菌（Pseudomonas）外，其他属水平物种皆对苦味呈现着显著的正相关性，这些菌属可能会是致使乳品发生腐败变质的关键因素。相关研究也证实了，即使这种能力只存在于某些属/种，包括类芽孢杆菌、绿芽孢杆菌属（Viridibacillus spp.）[31]，但这些菌株依然是牛奶在冷藏条件下变质的主要原因。

图4 巴氏杀菌乳电子舌味感与细菌多样性相关性热图分析Fig. 4 Heatmap analysis of the relationship between electronic tongue taste and bacterial diversity in pasteurized milk

3 讨 论

使用电子舌技术对乳制品样品进行分析，发现与人类味觉相比，味觉传感器具有更高的灵敏度。三点检验法品评出来的正确区分人数作为食品整体品质指标，结合Arrhenius动力学方程确定了鲜牛奶、豆奶的货架期预测模型并进行货架期预测。发现基于电子舌差别度方法预测的豆奶感官货架期偏差较大，比实际值高，但预测出的微生物货架期却比微生物方法的预测结果更为精确[32]。Yoshida等[33]利用味觉传感器客观地测定了24 位健康母亲和14 位乳腺炎母亲的乳汁的4 种基本味道——酸味、咸味、苦味和鲜味。研究发现，初乳向成熟牛奶的转变伴随着牛奶味道的变化，如咸味和鲜味降低，苦味和酸味增加。在这种情况下，由于钠、谷氨酸盐和磷酸鸟苷的含量增加，牛奶中鲜味和咸味增加最终导致炎症的产生。本研究发现，不同贮藏温度、时间下的巴氏杀菌乳均具有苦、咸、甜味及鲜味，酸味、涩味微弱，通过对测量数据进行检验发现，随着贮藏温度升高和时间增加，巴氏杀菌乳的咸、鲜、涩及苦味有明显的变化。

同时，Mizota等[34]也对牛奶的味道进行了研究，发现在牛奶均质过程中能够检测到细微的微生物变化[35]。在牛奶储存过程中，除了微生物的生长以外，使用偏最小二乘法和人工神经网络预测牛奶样品中的细菌生长过程也提供了令人满意的实验结果[36]。在贮藏过程中，对牛奶样品的细菌总数、酸度和黏度进行了测定，其理化性质在主成分分析图中表现出规律性。结果表明，该方法可用于监测未密封巴氏灭菌奶的质量储存时间[30]。相关研究结果表明，未封口的巴氏杀菌奶样品在-4 ℃存储后，利用电子舌法能够准确预测牛奶样品种的细菌总数和黏度[37]。例如，一些腐败微生物（如假单胞菌属、不动杆菌属等）能够破坏乳品的品质条件，从而对乳品企业的售卖带来明显的经济损失[38]。同时，研究发现，与乳制品行业相关的孢子形成菌（蜡样芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌）[39]，是作为奶粉质量检测的重要指标（嗜热菌）[40]，其可能会限制液态奶的保质期[30]。因此，微生物群落的组成取决于乳制品中存在的微生物及其储存条件所带来的影响[41-42]。本实验采用电子舌对于不同贮藏条件下的巴氏杀菌乳进行感官评价，研究分析鲜、咸、涩味下降的原因，这可能与巴氏杀菌乳中微生物的大量繁殖造成其品质腐败有关，高通量测序结果发现在贮藏期间含有气单胞菌、芽孢杆菌、沙雷氏菌、类芽孢杆菌、假单胞菌等菌属的存在，它们直接或间接影响着巴氏杀菌乳的味感及品质。同时，由大量数据分析结果也验证了电子舌仪器的稳定性及各传感器的分辨能力。将电子舌技术应用于检测不同新鲜度、不同热处理来源的乳制品，再通过微生物、理化等方面结合能够更好地探究乳制品中更为复杂的微生物世界提供了条件。