生物抗菌多肽在换牙期儿童专用牙膏中的应用

许 亮，汪明新，贾源宾

(南京映海月生物科技有限公司，江苏 南京 210014)

龋齿涉及牙齿结构、牙齿表面形成的微生物生物膜和糖类之间的相互作用，以及唾液和遗传影响[1]。多样性的口腔细菌被基质包裹附于牙齿表面，形成一层牙菌斑生物膜[2]。病原菌定值在牙齿表面形成的细菌生物膜并且分泌破坏牙齿微环境的物质，如产酸影响口腔pH是龋齿的主要原因[3,4]。

幼儿龋齿(ECC)是一种非常严重且最常见的慢性儿童期疾病，是一种由细菌介导的多因素疾病，其特征是≤6岁儿童的牙齿明显腐烂，并且近年来全球2至5岁儿童的龋齿患病率有所增加[5,6]。每天使用含氟牙膏刷牙对防龋有一定的作用[7]，但其对严重的口腔问题例如口腔溃疡、牙周炎等作用效果一般。一款适合的换牙期儿童专用牙膏对儿童的健康至关重要。现有具有杀菌功能的牙膏，有的添加抗生素、消毒剂，如三氯生、洗必泰等，将有害菌、有益菌全部杀死，破坏了口腔微生态环境，增加了细菌的抗药性。因此亟待开发出对口腔病原菌及进食过程中残留在口腔的外界病原菌有杀灭作用且能够促进口腔粘膜的修复和防御的新型牙膏，对换牙期儿童的健康非常重要。

大多数抗菌肽具有广谱的抗菌活性，且不容易产生耐药现象，除此之外一些抗菌肽还具有免疫调节作用，近年来抗菌肽在抗口腔病原微生物的应用方面成为研究热点[8,9,10]。因此，也可以考虑将抗菌肽加入牙膏用于日常防龋齿。抗菌肽Cbf-14(RLLRKFFRKLKKSV)及Cbf-K16(KFFRKLKKSVKKRAKKFFKKPRVIDVSIPF)是基于天然金环蛇毒素中提取并分离得到的BF-30(KFFRKLKKSVKKRAKEF FKKPRVIGVSIPF) 经结构改造、优化获得的小分子多肽，前期研究表明这三种多肽在体内外均具有广谱抗菌活性，且不容易产生耐药问题[11,12,13]。Magainin是由非洲爪蟾皮肤中提取的一类阳离子抗菌肽，MSI-78是源于Magainin 2的一种衍生肽，具有广谱抗菌效果，并曾经用于临床糖尿病足部溃烂的治疗[14]，MSI-1(GIWKFLKKAKKFWK)抗菌肽由MSI-78结构优化而来，活性及毒性均有所改善。

本研究主要比较了在换牙期儿童专用牙膏中应用的几种抗菌肽的体外抗菌效果。即测定MSI-1、Cbf-14、BF-30和Cbf-K16对临床常见金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、口腔龋齿和牙周炎主要病原菌变异链球菌，及口腔益生菌嗜酸乳杆菌的最小抑菌浓度(MIC)、最小杀菌浓度(MBC)；通过滤纸片法检测生物抗菌多肽牙膏对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及变异链球菌的杀菌效果；通过杀菌曲线(KCs)测定几种多肽对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和变异链球菌的杀菌效果，从而反映生物抗菌多肽牙膏的抗菌效果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

生物抗菌多肽牙膏主要成分为抗菌肽MSI-1、Cbf-14、BF-30、Cbf-K16，白芨提取物Bletilla striata，柔性水合硅石，木糖醇，山梨糖醇，甘油，月桂醇硫酸酯钠，纤维素胶，薄荷糖，维生素C，食品级草莓香精，纯化水。

阿莫西林胶囊(山东鲁抗医药股份有限公司)；甲硝唑(生物工程(上海)股份有限公司，纯度 > 98%)；抗菌肽MSI-1、Cbf-14、BF-30、Cbf-K16(吉尔生化(上海)有限公司合成、纯化，纯度 > 98%)；厌氧袋(三菱集团Mitsubishi Group)。

营养琼脂培养基；营养肉汤培养基；脑心浸液琼脂培养基；脑心浸液肉汤培养基；Mueller-Hinton(MH)琼脂培养基；Mueller- Hinton(MH)肉汤培养基，均由北京三药科技开发公司提供。

标准株：金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) ATCC 25923；大肠杆菌(Escherichiacoli) ATCC 25922；变异链球菌(Streptococcusmutans) UA140。临床株：金黄色葡萄球菌3株，大肠杆菌3株，均由东南大学附属医院检验科临床分离鉴定并提供。

1.2 仪器与设备

电子分析天平(CP64)，奥豪斯仪器(上海)有限公司；超净工作台(MSC-Advantage 1.8)，美国Thermo Forma公司；高压灭菌锅(MLS-3781L)，HIRYAMA公司；752紫外可见分光光度计(752N)，上海精密科学仪器有限公司；隔水式恒温培养箱(GNP-9160)，上海精宏实验设备有限公司；电热鼓风干燥箱(GZX-9076 MBE)，上海博迅实业有限公司医疗设备厂等。

1.3 实验方法

1.3.1 细菌培养

取-70℃保存的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的临床株和标准株，传代于营养琼脂斜面上，37℃培养16 h后，转接至营养肉汤培养基置于37℃培养箱培养8 h，用MH肉汤培养基倍比稀释成1 × 105CFU/ml左右的菌悬液备用。取-70℃保存的变异链球菌标准株，传代于脑心浸液琼脂培养基上，37℃厌氧培养16 h后，转接至脑心浸液肉汤培养基置于37℃培养箱培养8 h，用脑心浸液肉汤培养基倍比稀释成1×105CFU/ml左右的菌悬液备用。

1.3.2 多肽对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、变异链球菌及嗜酸乳杆菌的MIC/MBC测定

采用微量培养基稀释法测定多肽MSI-1，Cbf-14，BF-30，Cbf-K16对细菌的MIC值[15]。准确配制浓度为1024 μg/ml的多肽MSI-1，Cbf-14，BF-30，Cbf-K16及阳性对照药阿莫西林及甲硝唑，无菌条件下0.22 μm滤器过滤，用无菌MH肉汤培养基或脑心浸液肉汤培养基将各药品倍比稀释为512，256，128，64，32，16，8，4，2，1 μg/ml的溶液，取不同浓度的药液75 μl至96孔板，同时接种75 μl的1×105CFU/ml相应的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌或变异链球菌，使各药物终浓度为256，128，64，32，16，8，4，2，1，0.5 μg/ml。同时设置75 μl培养基加75 μl的1×105CFU/ml菌液作阳性对照组，150 μl的培养基作为不含药液和菌液的空白对照。将含金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的96孔板置37℃培养箱培养18 h，含变异链球菌的37℃培养箱厌氧培养18 h，酶标仪测定OD600，药物能够抑制细菌生长的最低浓度即为最小抑菌浓度(MIC)。

依次从上述未见细菌生长的96孔板中吸取100 μl培养液，加入无菌平皿中，倾倒恒温56℃的营养琼脂培养基或脑心浸液琼脂培养基10 ml，混匀，凝固后于37℃倒置培养或厌氧培养24 h，观察并记录各平板上的菌落数，菌落数小于5的最低浓度即为相应药物的MBC。

1.3.3 多肽对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和变异链球菌的杀菌曲线测定

用MH肉汤培养基或脑心浸液肉汤培养基将各试验菌液配制成1×105CFU/ml的菌悬液，吸取5 ml加入到无菌试管中，加入多肽MSI-1，Cbf-14，BF-30，Cbf-K16及阳性药阿莫西林及甲硝唑使各药物终浓度为4 × MIC，在0 h，0.5 h，1 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h向试管中吸取200 μl培养物进行梯度稀释及活菌计数，每个时间点设置三个平行对照。以细菌细胞数的对数值(lg)为纵坐标，以时间为横坐标，绘制多肽对各细菌的杀菌曲线。

1.3.4 生物抗菌多肽牙膏对细菌的抑菌活性测定

制备生物抗菌多肽牙膏含药纸片，含药量为10 μg，晾干，备用。采用MH肉汤培养基或脑心浸液肉汤培养基将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及变异链球菌稀释为1×107CFU/ml的菌悬液，取1 ml加入到无菌平皿中，随即加入恒温45℃的MH琼脂培养基或脑心浸液琼脂培养基，混匀，待凝固后，将制备好的含药纸片放置到培养基表面，并设置含生理盐水的纸片为阴性对照，将含金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的平皿置37℃培养箱培养18 ～ 24 h，含变异链球菌的平皿37℃培养箱厌氧培养18 ～ 24 h，观察抑菌圈大小。

2 结果与分析

2.1 多肽对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和变异链球菌的MIC/MBC

结果如表1所示，多肽Cbf-14、MSI-1、BF-30及Cbf-K16对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及变异链球菌均具有良好的抑菌活性，尤其Cbf-14对金黄色葡萄球菌标准株MIC值低至4 μg/ml，对变异链球菌MIC值为8 μg/ml。多肽MSI-1对大肠杆菌标准株及变异链球菌MIC值低至4 μg/ml。多肽对革兰氏阳性菌的抑菌效果明显优于阳性药阿莫西林，对大肠杆菌的抑菌效果稍差于阿莫西林。多肽Cbf-14、MSI-1、BF-30及Cbf-K16对口腔益生菌嗜酸乳杆菌基本没有抗菌活性。表2显示的是多肽Cbf-14、MSI-1、BF-30及Cbf-K16对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、变异链球菌及嗜酸乳杆菌的MBC。多肽MSI-1对大肠杆菌杀菌效果最好，MBC为8 μg/ml，与阿莫西林对大肠杆菌的MBC相当。甲硝唑对变异链球菌的MBC强于四种多肽，但其只对变异链球菌效果较好。同样多肽MSI-1及Cbf-14对嗜酸乳杆菌也没有杀菌效果。

表1 多肽MSI-1、Cbf-14、BF-30、Cbf-K16及阿莫西林、甲硝唑对细菌的MIC值Table l MIC of MSI-1, Cbf-14, BF-30 and Cbf-K16,Amoxycillin and Metronidazole against bacteria

表2 多肽MSI-1、Cbf-14、BF-30、Cbf-K16及阿莫西林、甲硝唑对细菌的MBC值Table 2 MBC of MSI-1, Cbf-14, BF-30 and Cbf-K16, Amoxycillin and Metronidazole against bacteria

2.2 多肽对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和变异链球菌的杀菌速率

测定多肽Cbf-14、MSI-1、BF-30及阳性药阿莫西林或甲硝唑对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及变异链球菌的杀灭能力。从图1A可以看出4 × MIC的多肽Cbf-14、MSI-1、BF-30对金黄色葡萄球菌具有较强的杀灭能力，其中BF-30在1 h之内便可全部杀灭细菌。MSI-1能够在2 h内杀灭全部金黄色葡萄球菌，Cbf-14能够在4 h内杀灭所有细菌。图1B显示的是4 × MIC的多肽Cbf-14、MSI-1、BF-30对大肠杆菌的杀灭能力。同样三种多肽对大肠杆菌均具有较好的杀菌能力，其中BF-30对大肠杆菌的杀灭效果最好，2 h内杀灭完所有大肠杆菌，MSI-1和Cbf-14在4 h之内便可杀灭所有大肠杆菌。图1C显示的是Cbf-14、MSI-1、BF-30对引起龋齿的主要病原菌变异链球菌的杀菌曲线，结果显示这三种多肽对变异链球菌也具有良好的杀菌效果，BF-30杀菌效果稍弱于甲硝唑，Cbf-14杀菌效果与甲硝唑相当，MSI-1优于甲硝唑。

图1 多肽MSI-1、Cbf-14及BF-30对细菌的杀菌曲线(A)对金黄色葡萄球菌的KCs；(B)对大肠杆菌的KCs；(C)对变异链球菌的KCsFig. 1 The time-kill curves of MSI-1 Cbf-14 and BF-30 against (a) S.aureus,(b) E.coli,(c) S.mutans.

2.3 生物抗菌多肽牙膏对细菌的抑菌活性

利用滤纸片扩散法检测生物抗菌多肽牙膏对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和变异链球菌的抗菌效果。图2 A显示的是含药纸片对金黄色葡萄球菌ATCC 25923的抑菌效果；图2 B是含药纸片在大肠杆菌ATCC 25922平皿上的抑菌圈；图2 A，B平皿上1，2均为含生物抗菌多肽的滤纸片，3，4滤纸片为生理盐水，跟阴性对照即生理盐水对照组相比含药纸片在金黄色葡萄球菌和大肠杆菌平皿上显示出明显的抑菌圈。图2 C(1，2为含生物抗菌多肽滤纸片，3为生理盐水滤纸片)为含药纸片在变异链球菌UA140平皿上的抑菌效果。同样也出现明显的抑菌圈。生物抗菌多肽对变异链球菌的效果略逊于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。结果说明，含抗菌多肽Cbf-14、MSI-1、BF-30的新型生物牙膏对口腔的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌及引起龋齿的主要病原菌变异链球菌均具有一定的抑制效果，即可一定程度上减少口腔炎症及牙菌斑的形成，利于营造一个健康的口腔环境。

图2 生物抗菌多肽牙膏对细菌的抑菌活性1, 2为生物抗菌多肽牙膏滤纸片；3, 4为生理盐水对照滤纸片。(A)对金黄色葡萄球菌的抑菌圈；(B)对大肠杆菌的抑菌圈；(C)对变异链球菌的抑菌圈。Fig. 2 Antibacterial activity of toothpaste. (a) Antibacterial activity of toothpaste against S.aureus, (b) Antibacterial activity of toothpaste against E.coli, (c) Antibacterial activity of toothpaste against S.mutans.

3 结论与讨论

本文研究了生物抗菌多肽牙膏中的抗菌肽成分对常见几种与口腔亚健康相关细菌的抗菌效果。多肽MSI-1及BF-30对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的ATCC标准株和临床分离株均表现出良好的抗菌活性，多肽MSI-1对大肠杆菌ATCC 25922及变异链球菌UA140效果最好；Cbf-14对金黄色葡萄球菌ATCC 25923效果最好。几种多肽对口腔致病菌均具有良好的抗菌活性，且对口腔益生菌嗜酸乳杆菌基本没有抗菌活性，即说明生物抗菌多肽牙膏的使用对口腔正常菌群的影响较小。

BF-30对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有良好的杀菌效果， 在1 h之内即能快速杀灭所有金黄色葡萄球菌，在2 h内杀灭所有大肠杆菌。MSI-1对变异链球菌的杀菌效果最好，2 h内完全杀灭。滤纸片扩散试验中含药组出现明显的抑菌圈，即说明该牙膏能够在日常使用中能够一定程度上控制并预防口腔龋齿、牙周炎及口腔溃疡的发生。

近年来发现口腔卫生不良、牙周炎可能会增加口腔菌血症及细菌性心内膜炎这些系统性疾病发生的风险。所以口腔疾病的日常防治工作尤其重要。生物抗菌多肽对口腔致龋菌的发生发展过程都会发挥作用，因此日常使用生物抗菌多肽牙膏可用于增强机体的抗龋能力。生物抗菌多肽在抗菌的同时，对口腔炎症也有一定的缓解作用[16]。生物抗菌多肽牙膏在儿童换牙期使用有助于减少儿童口腔龋齿的发生，具有广阔的应用前景。