西芹根腐病病原菌的分离与鉴定

扈 顺，高 婧，王 勇，王 永，席先梅，张 俊，周广俊，李艾兰

（1.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031；2.乌兰察布市商都县经济作物工作站，内蒙古 商都 013450）

西芹（Apium gravedens L.）属耐寒性蔬菜，原产于地中海沿岸地区，为伞形科芹属的栽培种[1]。西芹性凉，茎叶含有丰富的蛋白质、碳水化合物、矿物质及多种维生素等营养物质，口感脆嫩并具有清淡的香味，具有降血压、镇静、清肠利便、利尿消肿、治疗糖尿病、痛风、冠心病等作用[2]，被誉为保健蔬菜。内蒙古特殊的冷凉气候条件非常适宜西芹种植，该地区种植的西芹植株紧凑粗大、叶柄宽厚、高产优质，深受国内外客商青睐。内蒙古商都县从1993年引进西芹，已经由起初的小面积栽培发展成为当地农民增收的支柱产业之一，每年种植面积在0.13 万hm2左右，2014年商都西芹被审定为地理标志产品。然而，随着西芹种植面积的扩大、耕作土地的有限和轮作年限的缩短，近年来以“黑心烂根”为症状的根腐类土传病害发生普遍，严重影响了西芹的产量与品质。一般种植田发病轻时可造成20%～30%的产量损失，重度田块可达60%～80%，甚至绝收，极大地影响了农民种植西芹的积极性和收益的提高。根腐病已成为制约商都县西芹产业可持续发展的主要因素之一。目前，有关商都县西芹根腐病方面的研究还鲜有报道，为明确根腐病原菌的种类，有效地防治该病害，解决生产问题，本研究针对商都县西芹根腐病病原菌进行分离纯化，应用形态学和分子生物学方法对病原菌的种类进行鉴定，并对其致病性进行测定分析，旨在为西芹根腐病的致病机理、药剂筛选、抗病材料筛选、预测预警及综合防治等方面深入研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

2016—2017年，从乌兰察布市商都县小海子镇不同西芹种植田中采集发病的病株作为分离样品，包装好带回实验室尽快分离，观察并记录田间病株的表现症状。

1.2 病原菌的分离和纯化

病原菌的分离采用常规组织分离法，选择症状典型的西芹根茎部病健交界处组织作为分离病原菌的材料，用解剖刀将其切成0.3 cm×0.3 cm 的薄片状病样，将该病样依次经过75%酒精处理3～5 s，0.1%次氯酸钠处理2～3 min，无菌水漂洗3 遍。将病样晾干，在水琼脂平板上培养到长出菌丝，然后用解剖针挑取菌丝到PDA 培养基上（25±1）℃黑暗培养，待分离菌产孢后，采用单孢分离法[3]纯化培养，4 ℃冰箱中保存待用。

1.3 分离菌的致病性检测

1.3.1 西芹叶柄接种试验 选择健康的西芹叶柄作为接菌材料，首先用自来水冲洗、再用1%次氯酸钠溶液处理10 min、无菌水清洗3 遍。在无菌环境下，向每个铺有2 层灭菌滤纸的方形培养皿中倒入10 mL无菌水，以保持90%～95%的相对湿度，然后每皿放入4 个5 cm 长的叶柄段。将在（25±1）℃下培养10 d的菌饼（5 mm）倒置于西芹叶柄中间部位，每个叶柄上接种1 个菌饼，以空白培养基为对照，5 次重复。在（25±1）℃培养箱中恒温黑暗培养，观察西芹叶柄的发病情况。

1.3.2 西芹盆栽灌根接种试验 将灭菌土和灭菌沙以1∶1（体积比）混匀放于营养钵中（30 cm×25 cm），挑选健康饱满的“文图拉”西芹种子为试验材料，用自来水反复搓洗后，再用1%次氯酸钠溶液浸泡10 min和无菌水冲洗3 遍，然后将种子播种于营养钵中。待西芹幼苗长至10 cm 时，剪去营养钵底，并修剪幼苗须根。配制病原菌孢子悬浮液，孢子浓度为105个/mL，每个营养钵灌浇50 mL 孢子悬浮液置于平盘上正常培养，以加等量蒸馏水作为对照，每盆保留3 株西芹幼苗，3 次重复。观察西芹幼苗长势，28 d 后调查发病情况。

通过上述接种试验后，再次对发病的西芹进行病原菌分离，从培养性状和形态特征方面对分离到的菌株和从田间病样分离得到的菌株进行分析对比，并进行分子生物学鉴定。

1.4 病原菌鉴定

1.4.1 形态学鉴定 在PDA 培养基上对分离到的病原菌进行培养，观察不同时期的菌落特征，并对病原菌的孢子形态镜检[4]，初步确定病原菌的分类单元。

1.4.2 分子生物学鉴定 病原菌基因组DNA 的提取参照SAGHAI 等[5]的CTAB 法。PCR 扩增引物为ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTG-CGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。PCR 反应体系（50 μL）为2 mmol/L 10×PCR 缓冲液5 μL，2 mmol/L dNTP 2 μL，Taq 酶1 U，上下游引物各1 μL（10 μmol/L），DNA 模板100 ng，ddH2O 补到50 μL。PCR 反应程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35 个循环；72 ℃延伸10 min。获得的PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送北京厚生博泰公司进行序列测序。测序结果在GenBank 数据库进行BLAST 比对，获得同源性较高的镰孢菌ITS 序列，应用DNAMAN 进行序列比对分析，然后利用其构建西芹根腐病病原菌的系统发育树，明确病原菌系统进化情况。

2 结果与分析

2.1 田间发病规律及病害症状

通过田间观察发现，西芹在移栽定植后7～10 d开始发病，发病期持续40～50 d，主要为害西芹根部和茎基部。发病初期地上部分长势衰弱，开始萎蔫，晴天中午更为明显。被侵害部位初期产生红褐色，几天后变为水浸状暗褐色或黑褐色，根部呈黑褐色，根茎切面维管束层明显变色，呈褐色病变，叶片变黄，由下往上发展，但叶片不脱落。发病严重的植株病斑扩展成湿腐状，变黑不发臭，主根受害腐烂或坏死，侧根少，叶片严重萎蔫，最后植株萎蔫枯死，容易拔出（图1）。一般正茬地不发病，重茬地发病严重，随着重茬次数增多，发病率逐渐增加。西芹种植田发病后出现缺苗断垄现象，严重时成片死亡。

图1 西芹根腐病田间发病症状

2.2 病原菌的分离纯化

病样采自商都县小海子镇，从根茎部位的病健交界处共分离纯化得到4 株病原菌，命名为QC-3、QC-5、2QC-3 和XY1，进行后续研究。

2.3 病原菌的鉴定

2.3.1 病原菌的形态学鉴定 病原菌通过组织分离和单孢纯化后，分别获得QC-3、QC-5、2QC-3 和XY1 共4 个菌株，其中2 个病原菌的培养性状和形态特征见图2。在PDA 培养基上培养发现，这4 个菌株均形成圆形或近圆形菌落，边缘整齐呈放射状，开始均为白色，生长速度快。XY1 和QC-5 在PDA平板上培养，菌落突起絮状，菌丝白色质密，菌落白色，浅粉色至肉色；小型分生孢子着生于单生瓶梗上，大小为（7.8～15.3）μm×（3.5～5.6）μm，常在瓶梗顶端聚成球团，单胞，卵形；大型分生孢子镰刀形，大小为（14.6～38.5）μm×（4.5～5.9）μm，少许弯曲，多数为3 隔；厚垣孢子呈球形或近球形，间生或顶生，单独或呈链状，将菌株XY1 和菌株QC-5 初步鉴定为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）。2QC-3 和QC-3在PDA 平板上培养，呈现白色绒毛状圆形菌落；分生孢子有两种形态，小型分生孢子由发育良好的小型分生孢子梗形成，大小为（6.7～10.2）μm×（3.1～4.8）μm，呈卵圆形至柱形，有1～2 个隔膜；大型分生孢子镰刀形或长柱形，大小为（15.3～34.8）μm×（4.3～5.6）μm，直或稍弯，有较多的横隔；厚垣孢子球形，间生或顶生，将菌株QC-3 和菌株2QC-3 初步鉴定为茄病镰刀菌（Fusarium solani）。

图2 病原菌的培养性状和形态特征

2.3.2 病原菌的分子生物学鉴定 提取菌株QC-3、QC-5、2QC-3 和XY1 的基因组DNA，利用真菌通用引物ITS1/ ITS4 进行PCR 扩增5.8S 区段，4 个菌株都获得520 bp 左右的条带，将4 个菌株扩增条带的序列在GenBank 数据库进行BLAST 分析，菌株XY1和菌株QC-5 与尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）的同源性达到100%（图3），菌株2QC-3 和菌株QC-3与茄病镰刀菌（Fusarium solani）的同源性为100%。根据LANDEWEERT 等[6]研究认为真菌通过ITS 区域比对，序列相似性＞99%，鉴别为相同种；序列相似性介于95%～99%，鉴别为相同属；序列相似性≤95%，鉴别为相同科。因此，鉴定菌株XY1 和菌株QC-5为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum），菌株2QC-3 和菌株QC-3 为茄病镰刀菌（Fusarium solani）。另外，从GenBank 数据库中选取了Fusarium lateritium、Fusarium acuminatum、Fusarium chlamydo-sporum 作为内群，以向日葵黄萎菌Vd90（Verticillium dahliae）为外群，利用DNAMAN 软件Maximum Likelihood 方法构建系统发育树（bootstrap 值大于50 被显示，树枝上方数值为bootstrap 值）。菌株XY1 和菌株QC-5 与尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）聚在一个分支，菌株2QC-3 和菌株QC-3 与茄病镰刀菌（Fusarium solani）聚在一个分支，分子生物学鉴定结果和形态学鉴定结果一致（图4）。因此，将该病害命名为西芹镰刀菌根腐病。

图3 在GenBank 数据库中BLAST 比对结果

图4 西芹根腐病病原菌的系统发育树

2.4 病原菌的致病性

2.4.1 西芹叶柄接种 叶柄接种结果显示，QC-3、QC-5、2QC-3 和XY1 均能在西芹叶柄上寄生，接种1 d 菌丝已经开始生长，接种3 d 能使组织变色坏死，接种5 d 后叶柄上产生明显褐色病斑，而对照没有任何变化，说明分离到的4 株病原菌均对西芹有致病性（图5）。

图5 叶柄接种后发病症状

2.4.2 西芹盆栽灌根接种 接种QC-3 、QC-5、2QC-3 和XY1 的西芹幼苗均可产生病症。幼苗地上部分叶片变黄；洗根后，初步观察到褐色斑点，暗褐色坏死斑点逐渐扩大，导致侧根断裂、枯萎、斑腐，与田间根部发病症状一致。对照植株生长正常，无发病症状（图6）。

图6 盆栽灌根接种后西芹发病症状

3 讨论与结论

芹菜根腐病是由连作障碍引起的土传病害，在主要种植区发生比较普遍，是制约生产发展的一个重要因素。关于芹菜根腐病已有一些报道，吕佩珂[7]研究认为，芹菜黄化病由尖孢镰孢菌芹菜专化型引起；内蒙古太仆寺旗染病芹菜根系中分离出接骨木镰刀菌（Fusarium sambucinum）、链格孢菌（Alternaria alternata）、尖孢镰刀菌萎蔫专化型（Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum）、芬芳镰刀菌（Fusarium redolen） 及黄瓜萎蔫病菌（Plectosphaerella cucumerina）5 种致病菌，其中黄瓜萎蔫病菌在茎秆上的危害首次报道[8]。天津地区重茬地芹菜主要为镰刀菌侵染，初步鉴定为茄病镰刀菌（Fusarium solani）[9]。侧雄腐霉菌（Pythium paroecandrum）可引起北京地区芹菜根腐病[10]。山东地区芹菜根部及茎秆病斑处分离到黄瓜萎蔫病菌能致病[11]。由此可见，多数报道认为，引起芹菜根腐病的病原菌为镰刀菌属真菌，且随着不同种植区地理环境和土壤性质的变化，不同地区间芹菜根腐类病害的致病病原菌种类存在差异，根腐病病原菌的鉴定可为芹菜连作引起的病害防治提供一定的依据。

根腐病是一种真菌性病害，为商都县西芹种植区的常见病害，已造成不同程度经济损失。西芹根腐病病原菌以伤口侵染为主，定植移栽的过程中对根有损伤，或其他的农事操作容易导致根茎基部受到损伤，或地下害虫对根系危害，很容易被病原菌侵入。病原菌从根部为害植物，引起维管束病害后造成植株枯死。本试验从采集的病样中分离获得4 株病原菌，通过致病性测定、形态学观察和分子生物学检测鉴定为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）和茄病镰刀菌（Fusarium solani），这与其他地区芹菜根腐病报道有所差异，其原因可能是不同地区、不同菌株的生存环境不同所致。因此，本研究明确了商都县西芹根腐病主要是由尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌侵染引起的，称之为西芹镰刀菌根腐病，为该地区西芹根腐病的防治提供理论依据。但有关该病病原菌地域性的发生规律、侵染致病过程、致病机理、快速检测方法、抗原筛选及防治措施等方面还需进一步研究。