不同粒色玉米糊粉层含量研究与成分分析

冯汉宇　孙艳梅　洪燕　陈刚　韩立新　何京京　任君安

摘要 为了了解不同粒色玉米糊粉层含量与成分，对14个株系不同色籽粒糊粉层进行剥离、称重，取一些株系籽粒糊粉层进行纸层析和染色观察，结果表明不同色糊粉层重差异显著，重量10～20 mg，均值为14 mg，整粒籽粒糊粉层含量处于3.2%～8.2%，均值为5.7%;经过酸性的one-step blue染色的含花青素的糊粉层细胞呈鲜红和粉红色，碘-碘化钾染色的呈黄色，组化染色与分析发现糊粉层可能主要含有2种花青素和蛋白质，糊粉层细胞染色观察表明细胞主要含纤维素、蛋白质和花青素。

关键词 粒色;成分;糊粉层含量;染色

中图分类号 TS207.3文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）21-0170-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.21.051

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Aleurone Layer Content and Component Analysis of Different Kernels Color Maize

FENG Hanyu， SUN Yanmei， HONG Yan et al

（Beijing AgroBiotechnology Research Center，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Beijing 100097）

Abstract In order to understand the content and composition of aleurone layer in maize with different kernel colors， the aleurone layer of 14 lines with different kernel colors was peeled and weighed， and the aleurone layer of some lines was observed by paper chromatography and dyeing. The result showed that aleurone layer weights were significant different，the weights were 10-20 mg， the average value was 14 mg， the kernel aleurone contents were 3.2%-8.2%， the average value was 5.7%.Aleurone layer cells containing anthocyanins were fresh red and pink red by acid onestep blue dyeing and were yellow by iodineiodidum potassium dyeing.Aleurone layer mainly contained two kinds of anthocyanins and protain by test paper dyeing and analysis， aleurone cells mainly contained cellulose，protein and anthocyanins.

Key words Kernel color;Component;Aleurone layer content;Dye

基金項目 中国博士后科学基金面上项目（Z171100001117123）。

作者简介 冯汉宇（1980—），男，河南鹿邑人，博士，从事作物遗传育种及转基因玉米研究。

收稿日期 2019-04-08

玉米、大麦、小麦、高粱和水稻5种谷物糊粉层的大小虽不同，但其结构类似，糊粉层细胞壁一般较厚，胞质内主要为糊粉粒[1]。小麦糊粉层位于籽粒皮层的内层，介于种皮和胚乳之间，占籽粒的6%～8%，一般不含淀粉[2]。淀粉遇碘-碘化钾溶液变色，将碘-碘化钾溶液滴在纵切或横切的水稻颖果的切面上，直链淀粉为主的被染成蓝黑色，支链淀粉为主的被染成红褐色，个别籼糯稻糊粉层被染成蓝色含有少量单粒淀粉体[3]。玉米糊粉层位于种皮内层，介于种皮和胚乳之间（图1），除黄橙白色籽粒外，其他色籽粒糊粉层一般含有花青素。该研究从不同色籽粒糊粉层重和含量入手，对糊粉层进行理化染色，纸层析和显微观察，尝试阐明不同色糊粉层之间的异同、糊粉层主要成分，以期为糊粉层加工提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

以转C1基因的京501株系与京24杂交（京501和京24由北京市农林科学院陈刚研究员选育），在北京市农林科学院内，北京农业生物技术房山基地和三亚市玉米研究中心崖城育种站经过多代自交选育得到一些不同粒色株系，编号分别为A-30、A-28、A-45（11-1）、A-47（11-4）、A40-3（9-5）、A-43-5（10-2）、A-39（12-9）、B-14（9-2）、A-37（12-5）、A-44（10-7）、11-7和9-7;用吴忠义老师课题组提供的上海佑隆生物科技有限公司生产的转基因CP4EPSPS速测试纸抽样检测表明有些株系A-45（11-1）和A-40-3（9-5）叶片含有转入的CP4EPSPS，B-14（9-2）和A-37（12-5）不含CP4EPSPS（图2），京501、HiⅡ为非转基因材料。

1.2 试验设计与方法

1.2.1 糊粉层剥离与称量。取不同色玉米籽粒6粒，去掉下边与黑层相连的一部分，用清水浸泡，参考Chrispeels[4]获取糊粉层的方法并更改。第2天取糊粉层，用镊子挤压，将种皮与胚乳部分分离，然后用镊子撕下糊粉层，如果不能够撕下的就用刀片削下糊粉层，有些会带有一些淀粉，把带有淀粉的糊粉层片放在水里，去掉淀粉，然后一起装入小自封袋，放在试验台上晾干，每天14粒，连续6 d，共6个重复。称14个株系6个重复糊粉层重，并进行差异显著性分析，另取同样14个株系的6粒称重量，用于计算糊粉层含量，整粒籽粒糊粉层含量=糊粉层重/单粒重×100%，去果皮黑层糊粉层含量=糊粉层重/去果皮黑层粒重×100%，去果皮黑层和胚糊粉层含量=糊粉层重/去果皮黑层和胚的粒重×100%。

1.2.2 糊粉层染色与观察。取晾干的糊粉层用武汉赛维尔生物科技有限公司的碘-碘化钾染液和Biotium生物技术公司提供的酸性one-step blue蛋白质染液染色，剥离的糊粉层片上可能会带有淀粉，为了区分碘-碘化钾对淀粉层和糊粉层的染色情况，对个别株系籽粒淀粉层进行了染色，然后采用北京农业生物技术研究中心的Leica荧光正置显微镜观察，并用LASV4.5系统进行拍照。

1.2.3 糊粉层成分组化染色与纸层析。取称重后5粒种子糊粉层片加入小离心管中，用小改锥研磨粉碎，加入1 mL蒸

馏水，室温提取0.5 h，用层析滤纸吸取上清液，阴干后用pH为4.5含量95%的酸性乙醇染色，阴干后分别用pH为2.0的one-step blue和pH为2.0的酸性考马斯亮蓝R250染色。用吸管吸取上清液加入另外一个小离心管中，晾干，配制正丁醇、乙酸和水体积比4∶1∶5混合液和正丁醇、2 mol/L盐酸体积比1∶1的混合液作为展开剂对几个株系糊粉层研磨样进行纸层析[5]。

1.2.4 3个株系籽粒糊粉层细胞染色与观察。取3个株系A-40-3、A-47和B-14籽粒刮离的糊粉层，放在小离心管里，用小改锥研磨，用小滴管吸取0.2 mL即8滴蒸馏水加入其中，磨碎以后，用小滴管吸取一些滴在载玻片上，用one-step blue染液和碘-碘化钾染色，采用北京农业生物技术研究中心的Leica荧光正置显微镜观察，并用LASV4.5系统进行显微拍照。

2 结果与分析

2.1 单粒糊粉层重量与含量

通过对14个株系籽粒糊粉层进行称重和差异显著性分析及糊粉层含量的計算，发现不同色糊粉层重差异显著（表1）。重量在10～20 mg，均值为14 mg，9-7株系籽粒糊粉层最轻，B-14株系的糊粉层最重，分别为10和20 mg;整粒籽粒糊粉层含量处于3.2%～8.2%内，均值为5.7%，去果皮黑层糊粉层含量在3.6%～9.0%，均值为6.3%，去果皮黑层和胚糊粉层含量在3.9%～9.7%，均值为6.8%，A-28株系籽粒糊粉层含量较少，11-7株系籽粒糊粉层含量较多。

2.2 糊粉层染色结果

经过one-step blue染液染色的糊粉层为深浅不一的红色，碘-碘化钾染液染色的糊粉层为黄色，上面分布有黑色物质。白色的HiⅡ糊粉层和黄色的京501糊粉层经one-step blue染色后呈略微粉色，橙色的9-7糊粉层染色后为粉色，A-39、A-28、A-45、11-7和A-40-3株系籽粒糊粉层染色后为红色;HiⅡ、京501和9-7株系籽粒的糊粉层经碘-碘化钾染色后黄色糊粉层上黑色物质较少，A-39、A-28、A-45、11-7和A-40-3的株系籽粒糊粉层染色后黄色糊粉层上黑色物质较多（图3）。

2.3 淀粉层染色显微观察

观察发现碘-碘化钾染液染色的糊粉层色与淀粉层色不同，白色淀粉层染色后为黑蓝色，不考虑目镜倍数前提下，物镜10倍视野下块状、颗粒状淀粉为白色和黑蓝色2种，物镜20倍视野下发现块状、颗粒状白色淀粉颗粒为白色，染色的黑蓝色淀粉颗粒蓝色加强，而且有些淀粉颗粒中部透亮（图4）。

2.4 糊粉层染色显微观察

用酸性的one-step blue和碘-碘化钾染色以后，显微观察发现含花青素的A-39、A-28、A-45、11-7和A-40-3株系籽粒糊粉层内糊粉粒分为鲜红和粉红2种色，这可能与花青素种类及含量有关，京501、9-7和HiⅡ株系籽粒糊粉层内染色的糊粉粒略微显现浅粉色，糊粉粒外层有少量黑色丝状物包着;碘-碘化钾染色的含花青素的A-40-3、A-28、A-45、11-7和A-40-3糊粉粒与不含花青素的京501、9-7和HiⅡ糊粉粒都染成金黄色，外层包被有较多黑色丝状物，不染色的糊粉粒色泽多样，外层同样被丝状物包围着，只是较密集，这可能与糊粉层片厚薄有关（图5）。

2.5 组化染色的糊粉层成分

通过one-step blue，95%的酸性醇和考马斯亮蓝R250染色发现籽粒糊粉层含花青素的提取物质在纸上呈线条状分布，可分三层，一层砖红色花青素，一层鲜红色花青素，另外一层为蓝绿色或蓝紫色蛋白质，比如A-47、B-14、A-43-5、A-30和A-45;只有个别株系籽粒糊粉层仅有蓝色或绿色点状物，可能是蛋白质较少，比如A-39和A-40-3;自交系京501、9-7和HiⅡ只有一层蓝色或绿色物质，没有红色花青素（图6）。对A-40-3、B-14、A-37（12-5）和A-45采用95%酸性乙醇，正丁醇、乙酸和水混合液，正丁醇、盐酸混合液展开剂进行花青素纸层析分析，发现花青素分为砖红和鲜红2种色，只是分离不开（图7）。

2.6 碘-碘化钾与one-step blue染色的糊粉层细胞成分

不染色的B-14糊粉层细胞成空室，壁较厚，流出的花青素颗粒红色，one-step blue染色细胞鲜红色，外有稀疏的纤维素包被，解离的花青素细胞物质分散开来，纤维素呈网状连接，粉红色花青素颗粒分布其中，有个别蓝色蛋白质镶嵌在花青素颗粒中。A-40-3糊粉层细胞的花青素颗粒被碘-碘化钾染成黄红色，不染色的看不清楚，one-step blue染色的有的细胞自溶，有的含有蓝色螺旋状蛋白颗粒，有的外层有少量黑色纤维素，内层是红色花青素颗粒，包围着一些蓝色螺旋状蛋白质，有的细胞部分纤维素解离，露出一些蓝色螺旋状蛋白质，也有完整的细胞呈红色，被稀疏的黑色纤维素包着。不染色的A-47糊粉层细胞花青素颗粒呈紫红色，碘-碘化钾染色的花青素颗粒呈金黄色，one-step blue染色的A-47糊粉层细胞呈凝胶状，里面分布个别蓝色蛋白颗粒（图8）。

3 结论与讨论

3.1 结论

糊粉层是介于种皮和胚乳之间的一层或几层细胞，在禾谷类作物中广泛存在，花青素在籽粒中是主要分布于糊粉层中的一种色素。该研究表明不同色籽粒糊粉层重存在差异，重量10～20 mg，整粒籽粒糊粉层含量为3.2%～8.2%，去果皮黑层籽粒糊粉层含量为3.6%～9.0%，去果皮黑层和胚的籽粒糊粉层含量为3.9%～9.7%，均值分别为5.7%、6.3%和6.8%;经酸性one-step blue染液染色的含花青素糊粉粒分为鲜红和粉红2种色，组化染色分析表明糊粉层含有蛋白质和2种类型的花青素，糊粉层细胞主要含有纤维素、花青素和蛋白质。

3.2 讨论

种植业生产过程主要涉及种苗繁育、种植、肥水管理、有害生物防治、收获等[6]，关键控制点在于产地环境和投入品[7-8]，使用健康水，严格控制各种肥料、农药污染，才能促进玉米安全生产[9]，无公害玉米栽培过程中可以使用化肥、低毒农药进行病虫草害防治[10];该研究的玉米在选育和种植过程中，各试验点肥水管理和有害生物防治不同，在农林科学院内基地用井水灌溉，底肥施用复合肥，生育期间追氮肥，人工锄草，在崖城试验站主要靠井水灌溉，磷钾肥作底肥，播种后除草剂封闭，生育期间追氮肥，除草剂除草，房山基地播种前浇底墒水，生育期期间依靠降雨，人工锄草;各试验点都进行套袋授粉确保纯度和质量，在籽粒接近成熟的黄熟期收获，环境因素对籽粒糊粉层含量和成分影响不大。玉米湿法加工制备淀粉及副产物的过程，一般采用二氧化硫和乳酸浸泡液浸泡 [11];该试验采用清水浸泡玉米籽粒1 h，去种皮和黑层，然后再取出胚，需一直保持籽粒湿润，软化后才能剥离，晾干。小麦糊粉层含有大量蛋白质和纤维素，蓝粒小麦糊粉层含有花青素[12]，薏苡种子糊粉层细胞内充满大量糊粉粒，糊粉粒含蛋白質和不溶性多糖[13]，水稻种子糊粉层也含有大量蛋白质[14-16]，该研究表明含花青素的玉米糊粉层细胞主要含纤维素、蛋白质和花青素。

参考文献

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