ARTP-NTG复合诱变选育高产中性蛋白酶菌株

钱娟娟　王克芬　宋静静　刘胜利　王兴吉　刘文龙

摘要 以枯草芽孢杆菌A-06为出发菌株，利用ARTP-亚硝基胍（NTG）复合诱变方法对该菌株进行遗传改造。经过平板初筛，摇瓶复筛，最终筛选出一株酶活提高明显、遗传稳定的菌株N-36。其摇瓶发酵酶活达29 500 U/mL，较出发菌株酶活提高90%左右。

关键词 中性蛋白酶;ARTP;NTG;复合诱变;筛选

中图分类号 Q933文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）21-0005-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.21.002

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Screening of High Neutral Protease Producing Strains by ARTPNTG Compound Mutagenesis

QIAN Juanjuan， WANG Kefen， SONG Jingjing et al

（Shandong Long Kete Enzyme Co.， Ltd.， Shandong Province Key Laboratory of Enzyme Preparation Fermentation Technology， Linyi， Shandong 276400）

Abstract The original strain of Bacillus subtilis A06 was modified in genetic characteristics by ARTPNTG compound mutagenesis. One high neutral proteaseyielding strain N36 was screened from the mutants by slab screening and shake flask rescreening， which the enzyme activity increased obviously and had good genetic stability. The enzyme activity of the shake flaskfermentation reached 29 500 U/mL， which was 90% higher than that of the original strain.

Key words Neutral protease;ARTP;NTG;Compound mutagenesis;Screen

基金项目 国家重点研发计划（2017YFB0308400）。

作者简介 钱娟娟（1983—），女，山东威海人，工程师，硕士，从事酶制剂生产与开发工作。通信作者，工程师，硕士，从事酶制剂生产与开发工作。

收稿日期 2019-05-16

中性蛋白酶主要是由微生物发酵提取而得的，可用于各种蛋白质水解处理，水解产物为氨基酸、小肽等[1]。它是被最早发现并广泛应用于工业化生产的蛋白酶制剂，可用于皮革脱毛、畜禽血液蛋白质水解、酒和饮料的澄清以及医药治疗等领域[2-5]。近年，也有应用于多肽制备、降解棉酚、破乳等的相关研究[6-9]。相对国外酶制剂活性来说，国产酶制剂活性很低，而酶制剂活性的提高，关键需要采用合适的技术手段来选育高产菌种。

诱变选育具有优良性状的微生物菌種是发酵工业的关键环节，而诱变方法的选择是菌种选育能否成功的关键[10]。其方法有多种，如物理诱变、化学诱变及基因工程育种等[11-13]。新型的常压室温等离子体（ARTP）诱变育种技术在具有操作简易、条件温和的基础上，可达到一次诱变便能获得2万个以上突变体的大库容高效诱变[14-15]。亚硝基胍（NTG）作为一种超强诱变剂，是公认效果显著的化学超诱变剂。该研究拟采用ARTP-NTG复合诱变技术处理对数生长期的中性蛋白酶菌液，筛选酶活提高的菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 出发菌株。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），山东隆科特酶制剂有限公司菌种实验室保藏。

1.1.2 主要仪器与设备。

ARTP-IIS常压室温等离子体诱变系统（无锡思清源生物科技有限公司）;

ZXSD-A1270生化培养箱（上海智诚分析仪器制造有限公司）;

ZWF-B3612摇瓶机（上海智诚分析仪器制造有限公司）;

5810R离心机（德国Eppendorf公司）;

Plus384酶标仪（美国MD公司）;

UV-1800紫外可见分光光度计（日本岛津公司）。

1.1.3 试剂。

蛋白胨、酵母粉（美国BD公司）;

酵母膏、牛肉膏（北京奥博星生物技术有限责任公司）;

葡萄糖、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化锌、琼脂粉、酪蛋白均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）;

玉米淀粉、豆饼粉、麸皮（市售）。

1.1.4 培养基。

1.1.4.1 分离筛选培养基。蛋白胨1.00%、牛肉膏0.5%、氯化钠0.5%、酪蛋白1.00%、琼脂粉2.00%，pH 7.0。

1.1.4.2 种瓶培养基。蛋白胨1.00%、牛肉膏0.5%、酵母膏030%、葡萄糖1.00%、氯化钠0.2%，pH 7.0。

1.1.4.3 摇瓶培养基。玉米淀粉6.30%、豆饼粉2.00%、麸皮250%、Na2HPO4·12H2O 0.20%、KH2PO40.04%、ZnCl2 005%，pH 7.0。

3 结论

采用ARTP-亚硝基胍（NTG）复合诱变的方式对出发菌株枯草芽孢杆菌A-06进行遗传改造，经平板筛选，摇瓶发酵

培养，筛选到一株遗传稳定性良好的突变菌株N-36，其发酵

酶活力相对于出发菌株提高90%左右。試验结果表明，产中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌通过ARTP-NTG复合诱变，其诱变效应大大提高，该研究为选育具有优良性状的微生物菌种提供了依据。

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