油菜黑胫病病原菌致病力差异分析

荣松柏　李强生　初明光

摘要 通过人工接种的方法研究来自不同地区30份菌株的致病力（性）。结果表明，不同菌株间致病力存在差异，病情等级为1.92～8.84，以强致病力为主，占比73.3%。不同寄主对菌株的抗感反应也存在差异，可为病原菌菌群划分和育种提供理论依据。

关键词 油菜黑胫病;病原菌;致病力;人工接种;差异

中图分类号 S436.24文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）21-0136-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.21.040

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Analysis of Pathogenicity Differentiation of Leptosphaeria biglobosa in Brassica napus

RONG Songbai， LI Qiangsheng， CHU Mingguang

（Crop Institute， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei， Anhui   230031）

Abstract The pathogenicity of 30 isolates from different regions was identified by artificial inoculation in this study. The result showed the pathogenic varieties were obvious among the isolates， ranging from 1.92 to 8.84. The isolates with more aggressive pathogenicity were dominant， accounting for 73.3% in the experiment. The pathogenicity of the differential races was various， which provided a theoretical basis for the classification and breeding of pathogenic.

Key words Leptosphaeria biglobosa;Pathogenic bacteria;Pathogenicity;Artificial inoculation;Differentiation

基金项目 国家重点研发计划项目（2018YFD0100602）;院自主创新基金项目（17A0206）。

作者简介 荣松柏（1978—），男，安徽枞阳人，副研究员，硕士，从事油菜抗病育种研究。通信作者，博士研究生，研究方向：油菜抗病育种。

收稿日期 2019-09-03

油菜黑胫病（phoma stem canker）是世界性油菜真菌病害之一[1]，在加拿大、澳大利亚和欧洲很多国家都有大面积发生[2]。该病害有强侵染型菌（Leptosphaeria maculans）和弱侵染型菌（L.biglobosa）2种类型[3]。在致病性上前者强于后者，也是导致世界范围内油菜黑胫病害流行及危害的主要病原菌，据统计每年造成全球油菜经济损失约9亿美元[2]。研究者根据接种寄主对不同菌株抗感反应以及菌株致病性的差异，将L.maculans菌进行了菌群的划分[4-5];随着分子生物学的发展利用，完成了基因对基因的病原菌生理小种和抗性资源的研究[6-7]。 L.biglobosa在我国已普遍发生[8-9]，通过人工接种和田间自然诱导接种，已证明了L.biglobosa菌对油菜

产量及相关性状具有一定的影响[10]。但在病原菌类型、致病性等研究上较少。笔者从全国不同地区采集30份菌株，利用人工接种的方法研究其致病性差异，以期为研究病害菌群以及抗病育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株与品种

供试菌株为2009—2015年在全国油菜种植区采集的病株（表1），经实验室内分离、纯化和分子生物学PCR鉴定。菌株置于PDA（马铃薯葡萄糖琼脂）培养备用。供试油菜品种10个，均由安徽省农业科院作物研究所提供，其中国外品种5个，十字花科白菜品种1个（表2）。

1.2 方法

1.2.1 菌株分离纯化、孢子悬浮液配制。

切取边长约0.2 cm的病斑秸秆组织，经消毒、清洗等处理后置水琼脂培养基上，20 ℃黑暗条件下培养3～5 d，再挑取少量菌丝体在PDA上培养，反复多次，直至纯化[11]。无菌条件下挑取少量纯化后的菌丝在V8果汁琼脂培养基上培养5～7 d。产生孢子后用无菌水稀释，配制成浓度为107/mL分生孢子悬浮液[12-13]。

1.2.2 DNA提取和PCR 鉴定。

用干净的刀片从长满菌丝的培养皿（Φ为90 mm）中轻轻刮下菌丝，利用真菌DNA快速提取试剂盒（上海生工B518229）按照试剂盒操作说明提取DNA。

多重PCR引物从上海生物工程公司定购，由于病原菌有2种类型，引物A：5-CTTGCCCACCAATTGGATCCCCTA-3用于鉴定L.maculans，引物B：5-ATCAGGGGATTGGTGTCAGCAGTTGA-3用于鉴定 L.biglobosa， 引物 R：5-GCAAAATGTGCTGCGCTCCAGG-3为共同反向引物。20 μL PCR反应体系：40 ng DNA模 板，正向引物各100 ng，反 向 引 物 200 ng，4 μmol dNTPs，1U的Taq酶，30 mmol MgCl2，1倍PCR缓冲液，加ddH2O调至反应体积。引物PCR反应為常规SCAR反应程序，65 ℃退火。

[6] ROUXEL T，BALESDENT M H.The stem canker（blackleg）fungus，Leptosphaeria maculans，enters the genomic era[J].Mol Plant Pathol，2005，6（3）：225-241.

[7] VAN DE WOUW A P，LOWE R G T，ELLIOTT C E，et al.An avirulence gene，AvrLmJ1，from the blackleg fungus，Leptosphaeria maculans，confers avirulence to Brassica juncea cultivars[J].Mol Plant Pathol，2014，15（5）：523-530.

[8] WEST J S，EVANS N，LIU S Y，et al.Leptosphaeria maculans causing stem canker of oilseed rape in China[J].Plant pathology，2000，49（6）：800.

[9] 李强生，荣松柏，胡宝成，等.中国油菜黑胫病害分布及病原菌鉴定[J].中国油料作物学报，2013，35（4）：415-423.

[10] 荣松柏，胡宝成，陈凤祥，等.油菜黑胫病对油菜产量及农艺性状的影响[J].作物杂志，2015（6）：159-161.

[11] 陶炼.农作物病害研究之油菜黑胫病害[M].北京：光明日报出版社，2009.

[12] MENGISTU A，RIMMER R S，WILLIAMAS P H.Protocols for in vitro sporulation，ascospore release，sexual mating，and fertility in crosses of Leptosphaeria maculans[J].Plant disease，1993，77（5）：538-540.

[13] LI H，BARBETTI M J，SIVASITHAMPARAM K.Concomitant inoculation of an avirulent strain of Leptosphaeria maculans prevents breakdown of a single dominant genebased resistance in Brassica napus cv.Surpass 400 by a virulent strain[J].Field crops research，2006，95（2/3）：206-211.

[14] WILLIAMS P H，DELWICHE P A.Screening for resistance to blackleg of crucifers in the seeding stange[C]//VAN MERREWIJK N P A，TOXOPEUS H.Proceeding of the Eucarpia Cruciferae Conference.Wageningen，Netherlands：[s.n]，1979：164-170.

[15] 胡寶成.把论文写在大地上：参加国家油菜产业技术体系工作纪实[M].北京：中国农业科学技术出版社，2017.