改良QuEChERS法与LC-MS/MS联用测定水产品中13种农药残留

尹 怡 赵 城 余 权 李丽春 刘书贵 单 奇 马丽莎 郑光明*

（1 中国水产科学研究院珠江水产研究所/农业部水产品质量安全风险评估实验室（广州）/农业部休闲渔业重点实验室 广州510380 2 广州市刑事科学技术研究所 广州510030

我国是水产品生产大国，连续多年我国水产品生产总量居世界首位。随着水产养殖业的蓬勃发展，养殖水产品中农药残留问题日益突出，已成为社会关注的食品安全热点问题之一。水产品中的农药残留通常来源于两个方面：一是养殖过程施用药物来防治水产品的疫病和虫害，二是在环境施用的农药随雨水冲淋流入养殖水体。大部分农药具有亲脂性特点，养殖水体中的农药被水产品富集并通过食物链蓄积。为保护人类健康，各国政府加强了水产品中的农药残留的监控，制定了严格的最高残留限量。例如：日本政府制定的肯定列表制度中大部分农药的限量值为0.01 mg/kg。建立水产品中灵敏、可靠、多组分农药残留同时检测的技术十分必要。

多组分农药残留分析一般采用气相色谱（GC）[1-2]、液相色谱（LC）[3]、气相色谱-质谱联用（GC-MS）[4-7]、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）[8-11]和气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）[12-14]等。前处理过程多采用均质振荡[4，9]、加速溶剂萃取（ASE）[1-2]等技术提取，凝胶渗透色谱（GPC）[1-2，6-7]、固相萃取（SPE）[10]等技术净化。分散固相萃取法（QuECh-ERS）具有快速、简易、低价等特点，在蔬菜、水果的农药多残留检测中应用广泛[9-11]。近年来也用于测定动物源性食品中的农药残留[6-8]。QuEChERS方法在排除样品基质干扰和多残留分析方面具有显著优势，乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、C18和石墨化炭黑（GCB）等填料及其组合能有效去除基质干扰，然而这些填料普遍存在价格高、用量大等缺点，不利于推广和应用。发展价格低廉、快速高效、净化效果优越的改良吸附剂的QuEChERS 方法显得尤为重要。聚苯乙烯-二乙烯基苯（PS-DVB）是一种重要的人工合成材料，具有比表面积大，刚性强，耐酸碱，耐高温，使用寿命长及非特异性吸附低等特点，目前尚未见在QuEChERS 技术中应用。本文对QuEChERS 方法进行改良，选择体积分数1%的乙酸-乙腈溶液为提取溶剂，PS-DVB 和PSA 为QuEChERS 分散吸附剂，采用LC-MS/MS测定，建立水产品中氯嘧磺隆、异丙草胺、嘧菌酯、咪酰胺、烯酰吗啉、甲磺隆、三唑酮、噻嗪酮、唑螨酯、烯唑醇、多菌灵、噻菌灵和抑霉唑等13 种农药的分析方法。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与设备

API4000 三重四级杆质谱仪，美国AB 公司；1200 型高效液相色谱仪，美国Agilent 公司；旋涡混匀器，德国IKA 公司；超纯水机，美国Millipore公司；TDL-5-A 型离心机，上海安亭公司；N-EVAP 24 型氮吹仪，美国Organomation 公司；振荡器，德国IKA 公司。

1.2 主要材料与试剂

乙腈、甲醇和甲酸为色谱纯，德国Merck 公司；PSA，天津Agela 公司；PS-DVB，苏州赛分公司；氯嘧磺隆、异丙草胺、嘧菌酯、咪酰胺、烯酰吗啉、甲磺隆、三唑酮、噻嗪酮、唑螨酯、烯唑醇、多菌灵、噻菌灵和抑霉唑等13 种标准品，德国Dr.Ehrenstorfer 公司；无水醋酸钠和无水硫酸镁（分析纯），广州化学试剂厂。

1.3 标准溶液的配制

分别准确称取适量的农药标准物质，用甲醇溶解并定容，配得质量浓度约为1 000 mg/L 的标准储备溶液，于-20 ℃以下保存，保存期6 个月。

准确移取各标准储备溶液于棕色容量瓶中，用甲醇稀释定容配制10 mg/L 的混合标准中间溶液，于-20 ℃以下保存，保存期1 个月。准确移取适量混合标准中间溶液，加入空白样品提取液，配成系列基质混合标准工作溶液，4℃避光保存，保存期1 周。

1.4 试验条件

1.4.1 色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，50 mm×2.1 mm）；流动相：A 为体积分数0.1%甲酸-水溶液，B 为体积分数0.1%甲酸-乙腈溶液；流速：0.30 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL，梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Program of gradient elution

1.4.2 质谱条件 电离方式：电喷雾电离ESI+；采集模式：多反应监测（MRM）；气帘气：276 kPa；碰撞气：中等；离子源温度：500 ℃；Gas1 压力：276 kPa；Gas2 压力：414 kPa；离子喷雾电压：5 000 V。其它参数见表2。

表2 质谱参数Table 2 Optimized ESI MRM-MS instrument parameters

（续表2）

1.5 样品处理

准确称取（5±0.05）g 已绞碎混匀的水产肌肉组织于50 mL 具塞离心管中，加入20 mL 1%（体积分数）乙酸-乙腈溶液，并加入1 g 无水醋酸钠和1 g 无水硫酸镁，涡旋混匀2 min，水平振荡提取10 min，5 000 r/min 离心5 min。

将上清液移入含800 mg PS-DVB 和200 mg PSA 填料的50 mL 具塞离心管中，旋涡混合2 min，取10 mL 上清液于15 mL 离心管中，40 ℃水浴氮吹浓缩至近干。残留物用1.0 mL 流动相溶解，涡旋混合1 min 后，过0.22 μm 微孔滤膜，供LC-MS/MS 上机检测。

2 结果与讨论

2.1 优化的色谱条件

研究了水、甲酸分别和乙腈、甲醇组合的流动相体系对目标物的峰形及信号强度的影响，结果表明，用体积分数0.1%的甲酸-乙腈溶液为流动相时，大部分目标组分有较好的响应且峰形尖锐对称。其原因是：流动相中加入适量的甲酸，不仅促进目标物的电离，提高离子化效率和灵敏度，还抑制目标物与液相色谱柱固定相中硅羟基之间的作用，改善峰形，提高分离度。多残留分析中流动相基本为梯度洗脱，为保证梯度变化过程中酸的浓度和离子化氛围稳定，采用体积分数0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液作为流动相。采用LCMS/MS 分析13 种农药，MRM 谱图见图1。

2.2 提取溶剂

农药常用的提取溶剂为甲醇、丙酮和乙腈等溶剂，部分化合物需要加酸调节提取溶剂的pH值。为了保证提取效率，根据目标组分的化学性质，分别采用甲醇、乙腈、1%（体积分数）甲酸-甲醇溶液、1%（体积分数） 乙酸-甲醇溶液、1%（体积分数）甲酸-乙腈溶液和1%（体积分数）乙酸-乙腈溶液为提取溶剂，得到使用不同溶剂时13 种目标组分在加标虾肉中的回收率。采用甲醇为提取溶剂时，提取效率在30%～70%之间，可能是由于甲醇极性较强，盐析效果不佳。采用乙腈为提取溶剂时，目标组分有较好的溶解性，无机盐的加入使乙腈与水相分层，提高提取效率。同时，乙腈具有沉淀蛋白的作用，可大大减小杂质的影响。甲酸的酸性比乙酸强，部分农药在使用1%（体积分数）甲酸-乙腈溶液提取时回收率较低，而1%（体积分数） 乙酸-乙腈溶液在13 种目标组分的平均回收率在70%～120%之间。最终选择1%（体积分数）乙酸-乙腈溶液作为13 种农药的提取溶剂。

图1 13 种农药标准溶液的MRM 谱图Fig.1 MRM chromatograms of the 13 pesticide standards

2.3 净化过程的优化

水产样品含有大量的蛋白、脂肪和色素，这些杂质在提取过程中随目标物一起被提取出来，产生基质效应，影响检测结果。QuEChERS 方法中常用的吸附净化剂有PSA、C18及GCB。PSA 用于去除脂类和糖类物质，C18可去除油脂及弱极性杂质，GCB 可去除色素。PS-DVB 在QuEChERS 方法中的应用报道较少。其具有高容量、稳定的机械强度，与C18对比具有更强的吸附性能，且PSDVB 价格低廉，仅为传统吸附剂的1/5～1/3。

试验对比PSA、C18及PS-DVB 作为吸附净化剂的净化效果。考察这3 种吸附净化剂对13 种目标组分的吸附情况，在相同浓度的基质混合标准溶液中分别加入100 mg 的3 种吸附剂，旋涡混合1 min，过0.22 μm 微孔滤膜后测定。结果表明：C18对部分农药的吸附作用较强，回收率小于40%；而PSA 与PS-DVB 对大多数目标组分吸附较少，可作为净化剂进一步优化。本试验尝试将PS-DVB 与PSA 作为混合吸附净化剂，发现PSDVB 的加入可以改善对虾样品中的基质效应。以ME=Slopi/Slop0 评价基质效应，ME 为基质效应，Slopi 为基质匹配标准曲线的斜率，Slope0 为纯溶剂标准曲线的斜率[16]。由表3可知，加入PS-DVB后，氯嘧磺隆、异丙草胺、咪酰胺、烯酰吗啉、三唑酮、噻嗪酮、多菌灵、噻菌灵和抑霉唑等9 种化合物的基质减弱效应得到改善。同时考察了PSDVB 用量（200，400，800 mg 和1 000 mg）对目标物回收率的影响，结果表明，采用200 mg PSA 与800 mg PS-DVB 为净化剂组合时，基质效应较小，回收率最佳。

2.4 方法的线性范围、定量限、准确度和精密度

配制13 种农药的基质混合标准溶液，质量浓度为1，5，20，50 和100 μg/L，进样10 μL。以各农药的质量浓度（X）为横坐标，定量离子的峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线并做线性回归分析，结果显示：13 种农药在1～100 μg/L 范围有较好的线性关系，相关系数＞0.99。

在空白样品中添加13 种农药，信噪比（S/N）为3 时计算最低检出限（LOD）；S/N 为10 时计算最低定量限 （LOQ），13 种待测组分的LOD 在0.15～0.75 μg/kg，LOQ 在0.50～2.50 μg/kg，见表3。

用不含13 种农药的罗非鱼与对虾样品进行加标回收率和精密度试验，样品前处理过程同1.5节的步骤。在样品中分别添加5，20 μg/kg 和50 μg/kg 3 个含量水平，每个水平做5 次重复试验，13 种农药的回收率在75%～120%，相对标准偏差（RSD）为6.8%～15.0%，准确率和精密度均符合残留检测的要求。

表3 13 种化合物在对虾基质中的方法确证数据（n=5）Table 3 Methodology validation of 13 pesticides in shrimp（n=5）

2.5 实际样品测定及风险评估

采用本方法对市售的30 份水产品 （4 份罗非、2 份草鱼、2 份鲫鱼、2 份生鱼、2 份鲮鱼和18份对虾）进行测定，结果在其中的2 份虾肉中检出嘧菌酯，含量分别为58.4 μg/kg 和38.6 μg/kg。

嘧菌酯属于甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，最初用于谷物，现广泛用于农作物，具有预防和治疗作用。中国、美国与欧盟仅对多种农作物中的嘧菌酯进行限量要求，而日本肯定列表中规定鱼肉中的残留限量为0.08 mg/kg，未对虾进行规定。嘧菌酯的日允许摄入量（ADI）值为0.2 mg/kg bw，根据消费预测，2015年城镇居民人均年水产品消费量为19.34 kg[15]，人均日消费量为53 g。假定60 kg 的成年人食用上述阳性对虾，嘧菌酯的日摄入量=人均日消费量 残留量/体重=0.052 μg/kg bw，远远低于ADI 值。

3 结论

本研究建立了水产品中13 种农药残留的改良QuEChERS/高效液相色谱-串联质谱 （LC-MS/MS）检测方法，方法回收率为75%～120%，相对标准偏差小于15%。本方法简单、灵敏、快速且价格低廉，适用于水产品中农药残留的定性、定量分析。