纳米银对革兰氏阴性水产品腐败菌的抑制作用

刘小莉 图尔荪阿依·图尔贡， 王 帆 潘建林 付龙龙 努尔古丽·热合曼王 荣 周剑忠*

（1 江苏省农业科学院农产品加工研究所 南京210014 2 江苏省淡水水产研究所 南京210017 3 新疆师范大学 乌鲁木齐830054 4 泰兴市江之韵科技发展有限公司 江苏泰州225400）

纳米粒子是指尺寸在1～100 nm 间的粒子，处在原子簇和宏观物体交界的过度区域[1]。纳米保鲜技术是采用纳米包装材料或纳米保鲜剂对食品进行保鲜处理的一种技术，因金属银的杀菌能力最强，故含银粒子（离子）抗菌剂是目前研究最多的无机抗菌剂[2]。纳米银作为无机抗菌剂在食品贮藏保鲜中有着广泛的应用价值与应用前景。

我国是水产品生产与消费大国，水产品的收获期相对集中，携带大量的细菌，由于其营养成分不同于其它食品，即碳水化合物含量非常少，而蛋白质和游离氨基酸含量非常丰富，这些特性决定了水产品腐败的特征性腐败微生物不同于其它食品[3]。很多研究对水产品的腐败微生物生态进行了分析，认为荧光假单胞菌、腐败希瓦菌、发光细菌等革兰氏阴性菌是导致水产腐败的重要的腐败细菌，对水产品的安全构成生物危害[4-6]。目前我国水产品防腐保鲜体系相对滞后，现有的生物或化学合成保鲜剂，如Nisin、山梨酸钾、苯甲酸酸钠等主要对革兰氏阳性菌有很好的抑制效果[7]，而对革兰氏阴性菌作用很小，限制了水产加工行业的发展。

本研究以分离自腐败淡水鱼中的优势腐败菌作为抑菌实验指示菌，采用生物合成法制备的纳米银粒子，研究纳米银对水产品腐败菌，尤其是革兰氏阴性菌的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料

革兰氏阴性抑菌实验指示菌：普罗威登斯菌（Providencia vermicola）XLX5、变形杆菌（Proteus sp.）BY-2、摩根氏菌（Morganella sp.）JY-1、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）VP1，由自然腐败的淡水鱼中分离获得，于20%甘油管中-70 ℃保存。山梨酸钾、双乙酸钠、乳酸链球菌素为市售食品级添加剂，购于河南久易生物科技有限公司。钾（K）测定盒，购于南京建成生物工程研究所。其它试剂为分析纯级。

1.2 试验方法

1.2.1 纳米银的制备 采用生物还原法制备纳米银[8]。反应完成后，将合成的纳米银溶液在12 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min。弃上清，对纳米银颗粒沉淀重复水洗2 次，离心收集沉淀，冻干后收集纳米银粉末。以纯水溶解至质量浓度5 mg/mL，备用。

1.2.2 指示菌的培养 配制肉汤培养基（牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，琼脂12 g，水1 000 mL，调节pH7.0～7.2），121 ℃高压灭菌15 min，备用。液体活化采用不添加琼脂的液体肉汤培养液。-70 ℃保藏的菌株甘油管于室温下融化，吸取100 μL 保存菌种，接种于5 mL 肉汤液体培养基，37℃、120 r/min 培养24 h。

1.2.3 体外抑菌试验 采用平板孔阱扩散法研究纳米银的抗菌活性[9]。将活化好的试验指示菌种用冷却的肉汤培养基稀释至106CFU/mL 以上，倒平板。待培养基冷凝后，用直径7 mm 的打孔器于平板上均匀打出3 个孔，吸取纳米银溶液50 μL 注入孔中，37 ℃下分别培养24 h 后测量抑菌圈大小，计算平均值。另外，采用山梨酸钾、双乙酸钠、乳酸链球菌素，以无菌蒸馏水为溶剂，配制质量浓度为5 mg/mL 的溶液，作为阳性对照。

1.2.4 最低抑制浓度的测定 采用微孔板法测定纳米银溶液的最低抑制浓度（Minimum inhibitory concentration，MIC）[10]。将1.2.1 节中配制的纳米银用倍半稀释法配成梯度浓度的溶液。取96 微孔板，每孔中加入100 μL 菌含量约106CFU/mL 的含菌肉汤培养基液及100 μL 不同浓度梯度的纳米银溶液，对照组为无菌水。37 ℃下培养24 h，于波长600 nm 处测定各孔吸光度值。微孔溶液澄清的最小浓度作为MIC。

1.2.5 细菌胞内紫外吸收物质的泄漏试验 取对数生长期指示菌，5 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min，用0.75%生理盐水洗涤3 次，并用生理盐水稀释至菌液最终浓度为4.0×107CFU/mL，配制2 MIC 和4 MIC 浓度的纳米银溶液，将纳米银溶液和指菌液混合，使纳米银溶液终浓度为MIC 和2 MIC，37 ℃恒温孵育，每隔2 h 取样离心，取上清液于260 nm 处测定其吸光值，表征胞内紫外吸收物质的泄漏量。

1.2.6 K+离子泄漏试验 将对数生长期的指示菌菌液离心收集菌体，用生理盐水重悬菌体，加入纳米银溶液，终浓度分别为2 MIC 和MIC，菌液浓度为2.0×107CFU/mL，以去离子水作对照，37 ℃孵育24 h，每隔2 h 取样离心。取上清液测定不同浓度和不同作用时间条件下纳米银溶液对指示菌细胞中K+离子泄露的影响。

1.3 数据统计

采用Excel 2010 进行数据处理，所有数据重复3 次，结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 抑菌活性和最低抑制浓度

配制相同浓度的纳米银、山梨酸钾、双乙酸钠、乳酸链球菌素，采用平板孔阱扩散法研究体外抗菌活性，结果见表1。市售的3 种保鲜剂对4 种革兰氏阴性水产腐败菌没有抑制作用，而纳米银粒子对4 种菌都有良好的抑制效果，其中变形杆菌BY-2 对纳米银的敏感性最强，抑菌圈（19.38±0.40）mm，其次为副溶血性弧菌、摩根氏菌和普罗威登斯菌。进一步测定纳米银对4 种腐败菌的最低抑制浓度（表2），最低抑制浓度的结果验证了体外平板抑菌试验的结果。纳米银对变形杆菌BY-2 的最低抑制质量浓度为0.3125 mg/mL，副溶血性弧菌和摩根氏菌为0.6250 mg/mL，最不敏感的普罗威登斯菌为1.250 mg/mL。天然防腐剂乳酸链球菌素可有效抑制革兰氏阳性菌，而对革兰氏阴性菌不起作用[11]。山梨酸钾、双乙酸钠也是在全球范围使用广泛的化学防腐剂，抑菌谱相对较广，然而很多研究发现对革兰氏阴性菌的效果不显著[12-13]。所选用的3 种防腐剂对从淡水鱼中分离得到的4 种特征性革兰氏阴性菌均没有抑制作用，而纳米银表现出良好的广谱抑菌活性。

2.2 细菌胞内紫外吸收物质的泄漏

细胞膜是细菌的保护屏障，当细菌遇到强抑菌剂作用而破坏细胞膜时，菌体的保护屏障被打破，抗菌物质进入细胞内，和胞内蛋白质、DNA 等发生作用，导致胞内物质大量泄漏[14]。图1显示腐败菌胞内紫外吸收物质的泄漏结果，对照组紫外物质泄露很少，变化缓慢，而添加纳米银抑菌剂的菌悬液中紫外吸收物质泄漏随时间的延长逐渐升高，且不同指示菌的变化趋势差异显著，表明添加纳米银破坏了菌体细胞膜及其它质膜，导致质膜通透性增强，细胞内部的可溶性蛋白质泄漏以及附着在质膜上的蛋白进入溶液中。普罗威登斯菌XLX5 在不同纳米银抑菌剂浓度作用下，0～14h 内泄漏量没有显著差异，随着时间的延长逐渐呈显著差异。其它3 种指示菌对不同浓度的纳米银溶液较敏感，随着纳米银浓度的增加，紫外物质泄漏显著增加，其中变形杆菌BY-2 的胞内紫外物质泄漏最快。

表1 不同保鲜剂的体外平板抑菌活性Table 1 Inhibitory activity of different preservatives against the tested bacteria

表2 纳米银对腐败菌的最低抑制浓度Table 2 MIC of silver nanoparticles against the tested bacteria

图1 不同指示菌在纳米银溶液作用下紫外物质的泄漏Fig.1 UV-absorbing substances in the tested bacteria with silver nanoparticles

2.3 细胞内钾离子的外流

图2显示在纳米银溶液作用下不同指示菌菌悬液中钾离子浓度的变化情况。细胞中的钾离子有多种重要的生理功能，Na+-K+泵使细胞内、外的钠离子和钾离子维持一定水平，维持细胞渗透压，保持细胞的静息电位，也能使细胞膜内、外形成一定电势梯度，为物质跨膜运输提供能量。纳米银的作用使细胞膜的通透性被破坏，菌体细胞内部的钾离子外泄，扰乱了细胞的正常生理活动，菌体死亡，且随着纳米银浓度的增加而增加。谢海伟等[15]研究化学合成抗菌肽对致病性大肠杆菌细胞膜通透性的影响，发现作用20～30 min，K+泄漏急剧上升；40～50 min，趋向最大泄漏量。本研究中不同指示菌均在10～12 h 钾离子外泄呈急剧上升趋势，表明纳米银在抑菌过程中发挥缓释作用。

图2 不同指示菌在纳米银溶液作用下钾离子的泄漏Fig.2 K+ ion leakage in the tested bacteria with silver nanoparticles

3 结论

抑菌试验结果显示，与现有的常用商品化防腐剂相比，纳米银表现出良好的广谱抑菌活性，对本研究所选4 种革兰氏阴性水产腐败菌的生长有显著的抑制效果，最低抑制质量浓度为0.3125～1.250 mg/mL，而3 种市售防腐剂均无抑制活性。研究发现纳米银作用于腐败菌能破坏菌体细胞膜，使胞内蛋白质等紫外吸收物质及钾离子溶出，表现出良好的缓释性能，具有很好的应用价值。