网络药理学筛选天麻素防治糖尿病的分子机制

贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025

天麻(GastrodiaelataBL.) 为贵州道地药材，是常用而较名贵的中药材，临床应用广泛，在头痛眩晕、癫痫、小儿惊风等方面发挥重要作用[1]。主要含有：香荚兰醇、香荚兰醛、天麻素、多糖等化学成分，其中天麻素(gastrodin)含量最高[2]。天麻素药理作用广泛，毒副作用较，现代药理学研究表明，天麻素在心血管疾病、糖尿病、神经疼痛、帕金森病等有较好的治疗效果[3-4]。已经有文献表明：天麻素注射液、天麻素联合丹红注射液、天麻醇提物、乙酰天麻素等在糖尿病及其并发症中发挥作用[5-6]，但是作用机制尚未明确，为了进一步明确天麻素防治糖尿病调节的靶点，本研究采用网络药理方法，筛选天麻素作用的靶点，对其靶点进行通路分析、GO(Gene Ontology)功能注释、相互作用分析等，明确天麻素防治糖尿病的分子机制。

1 材料与方法

1.1 数据库与软件 STRING(https://stringdb.org/)；DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)； Cytoscape 3.5.1软件(http://www.cytoscape.org)；KOBAS3.0(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/index.php)；软件运行于 Windows 操作系统平台下，使用的相关软件已授权或开源软件。

1.2 天麻素靶标蛋白筛选 天麻素的mol2结构基于中药系统药理学数据库和分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology ,TCMSP)[7]下载，采用SYBYL对薏苡仁化合物加氢、加电荷，每个化合物进行能量优化。采用靶标蛋白筛选基于Swiss Target Prediction(http://www.swisstarge-tprediction.ch/)数据库，根据化学成分的2D 和 3D结构进行预测。可以预测五种不同来源的生物，基于Daylight FP2的分子指纹方法，并采用了Tanimoto系数定义的相似度度量方法。通过Swiss Target Prediction进行靶标预测，在线打开Swiss Target Prediction，在Choose an organism一栏中选择Homo sapiens。输入天麻素化学成分的SMILES,筛选天麻素靶标蛋白。

1.3 天麻素靶标蛋白生物功能分析 靶点GO功能分析基于DAVID 6.8(DAVID 6.8，https://david. ncifcrf.gov/)在线分析，将100个靶点导入DAVID数据库，点击限定物种为人源，设定阈值P<0.01，GO注释分析包含，即细胞组分(cellular component，CC)、生物过程(biological process，BP)以及分子功能(molecular function，MF)。

1.4 天麻素靶标蛋白靶标通路分析及ggplot 2构建网络模型 基于KOBAX3.0(KEGG Orthology Based Annotation System)对天麻素靶标蛋白进行通路富集分析，共有表达差异基因通过数据库整合到相应的Pathway条目。结果得到靶标蛋白参与的所有途径，筛选靶标蛋白显著参与的途径(P≤0.01)，通过Rstudio中的ggplot 2输出top 20通路，显示通路名称、Rich factor、富集分析的P值和Q值等。

1.5 靶标蛋白相互作用分析 基于STRING对天麻素靶标蛋白进行相互作用分析，物种设为“Homo sapiens”(人源)，下载string_ interactions.tsv文件，导入Cytoscape 3.5.1软件，基于 Cytoscape 3.5.1 软件中的的Cytohubba模块筛选关键靶点[8-9]。

1.6 分子对接及关键氨基酸位点 采用Surflex-Dock 模块完成分子对接研究[10]。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(1U8F)从蛋白质晶体结构数据库RCSB (http://www.rcsb.org/pdb ) 获取 3D 晶体结构[11]。基于Surflex-Dock 模块完成分子对接研究(标准模式)。选择配体(Ligand)模式产生活性口袋；其他参数均采用 SYBYL默认值，筛选结果以Total-Score>5为阈值[12]。基于Ligplot 对天麻素和GAPDH进行相互作用分析。

2 结果

2.1 天麻素靶点GO功能注释分析 基于DAVID对天麻素靶点进行GO注释分析(表1)，生物过程中，100个靶点主要参与one-carbon metabolic process(碳代谢过程)、response to drug(药物反应)、proteolysis(蛋白水解)；主要存在plasma membrane(质膜)、melanosome(黑素体)、dendrite cytoplasm(树突细胞质)等；分子功能上，100个靶点主要有insulin receptor substrate binding(胰岛素受体底物结合)、phosphatidylinositol 3-kinase binding(磷脂酰肌醇3-激酶结合)等分子功能。

2.2 天麻素靶标蛋白通路分析 采用DAVID 数据库对天麻素靶点进行通路富集分析，100个靶标蛋白显著参与102条通路途径(P<0.05)，采用R语言的ggplot 2输出20条通路(图1)，其中包括胰岛素信号通路(Insulin signaling pathway)、TNF信号通路、胰岛素抵抗等，详见表2。

表1 潜在靶点的GO生物学过程富集分析

续表1

表1 潜在靶点的GO生物学过程富集分析

表2 通路富集分析

续表2

表2 通路富集分析

图1 通路分析

2.3 天麻素靶标蛋白相互作用分析 基于Cytoscape 3.5.1中的Cytohubba模块，对100个靶标基因进行相互作用分析，根据degree(度)的大小，输出前30个靶标基因(表3)，颜色越深，靶点越重要。100个靶标蛋白中GAPDH为最关键靶点。

表3 关键基因

通过靶点相互作用分析，发现GAPDH为核心靶点，将采用分子对接进一步研究。天麻素与GAPDH形成4个氢键：Asp 35，Arg 16，Thr 99，Ser 122；天麻素与氨基酸Phe 37，Ser 98，Gly 100，Ile 14，Gly 12，Pro 191和Ile 38形成疏水作用(图2)。

2.4 分子对接及氨基酸位点分析 利用 Surflex-Dock 分子对接模块的 Total-Score 打分函数对小分子与靶标蛋白相互作用进行评分，Total-Score值愈大，说明小分子化合物与大分子蛋白质的匹配结合作用越好。天麻素与GAPDH分子对接结果为Total-Score=7.5，进一步验证靶点相互作用的结果。说明天素与GAPDH有较强列的结合。

注: a:天麻素化学结构 b:天麻素与GAPDH相互作用分析图2 天麻素调节的关键基因

3 讨论

天麻素药理作用广泛，具有较好的应用前景[13]。已经文献[14-15]表明：天麻素在脑缺血再灌注损伤、短暂性脑缺血、眩晕症等多种疾病中发挥较好的治疗效果。通过分子对接发现天麻素与甘油醛-3-磷酸脱氢酶( glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH )有较好的结合(Total-Score=7.5)，GAPDH参与能量代谢，同时也具有其他生理功能，与糖尿病密切相关。GAPDH在多种组织和细胞中表达。Min等[16]研究表明：GAPDH通过激活磷酸酶的活性对胰岛素通路具有调节作用；同时由于糖尿病引起的视网膜病变、血管内皮组织的损伤等并发症的发生与GAPDH关系密切。GAPDH为多功能蛋白，目前，对机体的生理和病理状态下的作用值得深入的研究。对于开发GAPDH的抑制剂和诱导剂有较好的应用前景，尤其是GAPDH与胰岛素通路关系密切，为糖尿病的防治提供一个崭新的药理靶向。

已有文献[17]证实天麻素具有防治糖尿病的作用。白永等人通过免疫组化、蛋白印记、PCR等技术明确天麻素可以降低胰岛素抵抗的同型半胱氨酸的含量；Sun等[18]观察天麻素对STZ诱导痛性糖尿病神经病变(PDN)的实验动物模型的作用。对糖尿病引起的瞬态钠电流、钾电流有一定的对抗作用。目前，天麻素作用的靶点尚未完全明确，本研究通过分子对接发现GAPDH为天麻素核心靶点，通过分子对接发现天麻素与GAPDH有较好的结合。而且明确Phe37、Ser98、Gly100、Ile14、Gly12、Pro191、Ile38为关键氨基酸位点。可以推测这些残基就是 GAPDH的重要残基，其在决定酶的催化特性中起到了重要作用。

基于DAVID对天麻素调节的靶点进行通路分析，包括胰岛素信号通路、TNF信号通路、胰岛素抵抗等与糖尿病发生、发展密切相关的通路。目前，天麻素药理作用的研究尚未全面、系统的分析，本研究采用网络药理学筛选天麻素调节的靶标蛋白，对靶标蛋白进行功能分析、通路分析、蛋白相互作用分析，最后采用分子对接技术验证天麻素与关键靶点的结合，明确其发挥药理作用的分子机制，从而为天麻素的应用及天麻制剂开发奠定基础。