环境微生物快速鉴定与检测技术研究进展

摘  要：微生物廣泛分布于水、空气、土壤等多种环境介质中，并在其中发挥重要作用。当今微生物分析标准主要方法仍是传统的培养方法，然而，培养法存在培养周期长、特异性差、敏感度不高、无法检测活的非可培养态细菌^[1]。如何准确、快速、有效地对不同环境介质中微生物进行鉴定与监测，已经成为国内外微生物研究领域的热点。本文综述目前环境领域的微生物鉴定与监测技术，对不同方法进行比较分析，旨在分析各种方法的利弊，为有效获取微生物监测数据提供依据。

关键词：环境;微生物;鉴定;监测

中图分类号：Q938 文献标识码：A  文章编号：1671-2064（2019）16-0000-00

1 微生物定性定量分析

用于微生物定性定量分析方法包括聚合酶链反应（PCR）、荧光定量PCR（qPCR）、数字PCR（dPCR）和荧光原位杂交（FISH）等。

1.1 PCR

常规的PCR主要是基于温度变化时DNA链“变性-复性-延伸”的原理，通过设计特异性的引物，对目标微生物的特征基因片段进行扩增，从而判定样品中是否含有某类微生物及其浓度。PCR扩增的终产物可根据后续电泳条带位置和亮度进行定性和半定量分析。

1.2 qPCR

荧光定量PCR技术在PCR体系中加入荧光探针或荧光染料，利用荧光信号变化实时监测PCR扩增过程中每一轮循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线对起始模板进行相对和绝对定量。优点是灵敏度更高，特异性更强，实现实时定量分析。Knappik等比较细菌培养法和qPCR等方法在检测老挝土壤和水体中类鼻疽伯克霍尔德杆菌的差异^[2]。结果表明对于土壤和水体样品，经富集培养后使用qPCR法的样品阳性检出率显著高于单独培养法和单独qPCR法。

1.3 dPCR

qPCR依赖扩增曲线Ct值定量，受不同样品间扩增效率影响较大，而dPCR不依赖于Ct值即可进行定量。原理是将DNA样本溶液随机分配到大量独立反应单元，在每个反应单元进行PCR扩增，根据泊松公式通过统计反应单元荧光信号来定量DNA。Doi等比较使用液滴数字PCR（ddPCR）和qPCR技术检测池塘中侵入性蓝鳃太阳鱼的环境DNA（eDNA）^[3]。表明使用ddPCR比qPCR有更高的检出率，ddPCR对水体中存在的有机质PCR抑制物有更好的抵抗性能，在eDNA检测方面比荧光定量PCR更具优势。

1.4 FISH

FISH利用非放射性荧光物质标记的DNA或RNA序列作为探针，按照碱基互补原则，与待测样品的DNA或RNA进行特异性结合，再通过荧光显微镜等观察研究微生物特定核苷酸序列的存在、数目和定位^[4]。FISH具有快速、可原位和定量分析等优点，但由于细菌普遍存在的自发荧光现象可能导致假阳性结果^[5]。

2 微生物群落结构分析

用于微生物群落结构分析的方法较多，比较常见的有传统变性梯度凝胶电泳（DGGE）、末端限制性酶切片长度多态性（T-RFLP）等方法。近年来，高通量测序技术（High Thoughput Sequencing）迅猛发展，逐渐成为微生物群落结构分析的主要研究手段。

2.1 DGGE

DGGE技术是在普通凝胶电泳基础上发展起来的DNA分离技术，最早由Lerman等提出^[6]。主要原理是碱基序列存在差异的DNA在含不同浓度变性剂的聚变稀酰胺凝胶中解链行为不同，根据电泳迁移速率的变化，可以将片段大小完全相同、仅碱基组成不同的DNA片段分开。经DGGE变性分离的DNA条带割胶回收后可以进行图谱聚类分析或序列分析^[7]。在微生物群落结构及多样性分析研究中，普遍采用PCR-DGGE是先将提取的样品DNA进行PCR扩增后，再进行DGGE分离、测序。DGGE也存在如下缺点：

1. 实验步骤较为繁琐，摸索最适实验条件耗时较长;
2. 由于16SrDNA不同拷贝之间的多态性，易导致对种群细菌丰度的高估;
3. 只有占群落细菌数量一定比例的类群才能被DGGE检测;
4. 对DGGE条带中微生物分类鉴定还需要进行条带切割、PCR扩增、分子克隆并测序，由于分辨率低，所割取的亮带常包含两种以上微生物^[8]。

2.2 T-RFLP

利用T-RFLP技术分析微生物群落，首先确定目标DNA片段，根据目标基因上的保守区域设计一对引物，其中一个引物的5末端用荧光物质标记。然后提取待测样品总DNA，经PCR扩增后，扩增产物的一端带有这种荧光标记物。再利用适当的限制性内切酶消化PCR扩增产物，获得长短不一的限制性片段（T-RFs），通过DNA测序仪对末端带有荧光标记物的片段进行检测。由于核苷酸序列具有多态性，不同长度的末端限制性片段可代表不同的微生物，而相同长度的末端限制性片段则代表至少一种微生物的存在，因此T-RFLP技术可以用来反映微生物菌落组成的情况^[9]。T-RFLP技术具有分辨率高、简单快速、易于实现自动化等特点。但T-RFLP实验过程中影响因素众多，样品总DNA提取、PCR条件优化以及限制性内切酶的选择均对结果产生影响^[10]。此外，T-RFLP图谱中每个T-RFs可能不止对应一个菌种，易造成对细菌种群多样性的低估^[11]。

储昭瑞等通过对SILVA（R108） SSU Ref数据库中400条厌氧氨氧化菌16S rRNA基因序列的分析^[12]，建立了厌氧氨氧化菌特异性T-RFLP方法。该方法能够有效、稳定地应用于环境样品中厌氧氨氧化菌群落组成的快速分析。Aida等使用T-RFLP和高通量测序技术在上升流厌氧污泥床反应器处理城市污水过程中研究厌氧硫氧化和微生物多样性的关系^[13]。

2.3 高通量测序

最早的第一代测序（First Generation Sequencing， FGS）技术由Wu等提出^[14-16]。Margulies等在Nature发表“Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors”一文^[17]，标志着高通量测序技术时代的到来。又称第二代测序（NGS）技术，该技术一次可对上百万条DNA分子进行序列测定，通量高，信息量大。

目前高通量测序技术已经发展到第三代（TGS）。最大特点是单分子测序技术（SMS），测序无需经过PCR扩增过程。Harrs等在Science首次报道他们开发的真正单分子测序技术（TSMS）^[18]，原理是在随机打断的待测DNA样品片段末端添加poly（A），然后与检测芯片的poly（T）杂交、定位，并逐一加入荧光标记的末端终止子，洗涤、采集荧光信号后，切开荧光染料和抑制基团，再洗涤、加帽，掺入下一个核苷酸，进行下一轮反应，最终获得完整的序列信息。其后，Pacific Biosciences 公司推出了单分子实时技术（SMRT），该方法在聚合反应的同时就可以读取测序产物，其测序速度快，并且具有读数超长的优点^[19]。目前关于高通量测序技术的研究层出不穷，如何降低测序成本，快速对海量测序数据信息进行分析是今后的研究重点。

参考文献

[1]Salma M.， Rousseaux S.， Sequeira-Le Grand A.， et al. Characterization of the Viable but Nonculturable （VBNC） State inSaccharomyces cerevisiae[J].Plos one.2013，8（10）：e77600.

[2]Knappik M.， Dance D A B.， Rattanavong S.， et al. Evaluation of Molecular Methods to Improve the Detection ofBurkholderia pseudomalleiin Soil and Water Samples from Laos[J].Applied and Environmental Microbiology.2015，81（11）：3722-3727.

[3]Doi H.， Takahara T.， Minamoto T.， et al. Droplet Digital Polymerase Chain Reaction （PCR） Outperforms RealTime PCR in the Detection of Environmental DNA from an Invasive Fish Species[J].Environmental Science & Technology.2015，49（9）：5601-5608.

[4]李冰冰，肖波，李蓓等.FISH技术及其在环境微生物监测中的应用[J].生物技术，2007，17（5）：94-97.

[5]陈瑛，任南琪，李永峰等.微生物荧光原位杂交（FISH）实验技术[J].哈尔滨工业大学学报，2008，40（4）：546-549.

[6]Lerman L S.， Fischer S G.， Hurley I.，et al.Sequence-determined DNA Separations[J].Annual Review of Biophysics and Bioengineering.1984，13：399-423.

[7]卢永，陈秉娟，申世峰等.PCR-DGGE在水处理微生物群落多样性分析中的应用[J].化学与生物工程.2009，26（5）：55-59.

[8]张珍妮，吴晓芙，陈永华等.DGGE技术在环境微生物多样性研究中的应用[J].生物技术通报.2009，（12）：48-52.

[9]罗剑飞，林炜铁，任杰等.T-RFLP技术及其在硝化细菌群落分析中的应用[J].微生物学通报.2008，35（3）：456-461.

[10]罗佳捷，李丽立，张彬等.T-RFLP技术及其在微生物群落结构研究中的应用[J].中国畜牧兽医.2009，36（7）：75-78.

[11]余素林，吳晓磊，钱易等.环境微生物群落分析的T-RFLP技术及其优化措施[J].应用与环境生物学报.2006，12（6）：861-868.

[12]储昭瑞，李相昆，孟令威等.T-RFLP技术在厌氧氨氧化菌群结构分析中的应用[J].哈尔滨工业大学学报.2013，45（2）：26-30.

[13]Aida AA.，Kuroda K.，Yamamoto M.，Nakamura A.，Hatamoto M.，Yamaguchi T. Diversity Profile of Microbes Associated with Anaerobic Sulfur Oxidation in an Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor Treating Municipal Sewage[J].Microbes and Environments.2015，30（2）：157-163.

[14]Wu R.，Kaiser A D.Structure and Base Sequence in the Cohesive Ends of Bacteriophage Lambda DNA[J].Journal of Molecular Biology.1968，35（3）：523-537.

[15]Wu R.Nucleotide Sequence Analysis of DNA. I. Partial Sequence of the Cohesive Ends of Bacteriophage Lambda and 186 DNA[J].Journal of Molecular Biology.1970，51（3）：501-521.

[16]Wu R.，Taylor E. Nucleotide Sequence Analysis of DNA. II. Complete Nucleotide Sequence of the Cohesive Ends of Bacteriophage Lambda DNA[J].Journal of Molecular Biology.1971，57（3）：491-511.

[17]Margulies M.， Egholm M.， Altman W E.， et al. Genome Sequencing in Microfabricated High-density Picolitre Reactors[J]. Nature.2005，437（7057）：376-380.

[18]Harris T D.， Buzby P R.， Babcock H.， et al. Single-molecule DNA Sequencing of a Viral Genome[J]. Science. 2008，320（5872）：106-109.

[19]Eid J.， Fehr A.， Gray J.， et al. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules[J]. Science.2009，323（5910）：133-138.

收稿日期：2019-06-26

作者簡介：吴根英（1986—），女，浙江龙泉人，硕士，工程师，研究方向：环境保护。