动物源性食品中克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇快速检测产品的稳健性评价

喻俊磊,陈 沙，李雨露，李 晴，赵淑娟，兰 伟

(江西省食品检验检测研究院,江西 南昌 33000)

瘦肉精是一类人工合成的β-受体激动剂，因其可以提高瘦肉率和促进动物生长，而被一些畜牧养殖户和养殖企业作为养殖促进剂使用。根据其结构差异可分为克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇。人食用了饲喂瘦肉精的禽畜产品后，会引起食物中毒，我国农业农村部公告第235号规定严禁在畜牧生产中使用各种β-受体激动剂类药物[1-5]。目前，市售瘦肉精三联快速检测卡大多可同时测定猪肉中的克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇。2015年新版《中华人民共和国食品安全法》[6]规定：“采用国家规定的快速检测方法对食品进行抽查检测，被抽查人对检测结果没有异议的，可以作为行政处罚的依据”，在某种程度上给快检结论赋予了法律效力。快检方法有别于大型仪器方法，是一种包括样品前处理，短时间内能对相关质量安全指标得出检测结果的技术[7-8]，食品快检具有简便、及时、现场可视化等特点，由此催生食品快检行业及快速检测方法的高速发展[9-10]。然而目前对快检产品的评价属于备案制时的准入评价，而实际是快检试剂应该类似于交钥匙工程，需要考虑运输、储存、使用等环节的影响，目前缺乏这方面的评估研究。在基层监管人员使用快检产品进行食品安全监管时，普遍存在检出率低的情况，这与监督抽检等平均不合格率结果相差较大[11]。本文选取β-受体激动剂快检产品作为研究对象，通过实验对瘦肉精快检产品进行稳健性评估，从而建立完整的瘦肉精快检产品稳健性评估研究体系，用稳健性评估来解决快检产品不准确的困惑,具有重大意义。同时为食品监管部门购买和使用快检产品提供科学依据，为快速检测操作人员提供技术指导。

本研究以瘦肉精胶体金免疫层析试纸条的评价为切入点，系统性地研究胶体金免疫层析类食品快检产品评价过程中具体的操作问题，主要包括不同温湿度、贮存时间、模拟振动、样品基质干扰、不同熟练工操作等。对快检产品稳健性进行系统性的评价。在国家规范内，做好产品评价过程中的每一个细节，发现存在的问题并探讨在实际工作中的解决方法。本研究可为各级监管部门提供实践依据，为快检产品评价提供技术借鉴，有利于快检市场的规范化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇标准品(纯度≥98%，由国家粮食局科学研究院提供)；同位素内标：克伦特罗-D9、沙丁胺醇-D3、甲醇(色谱纯，由SCHARLAB S.L.公司生产)、乙醇(分析纯，由西陇科学股份有限公司生产)、NY针头式过滤器(WondaDisc Ⅱ，由SHIMADZU-GL公司生产)、磷酸缓冲液(10 mmol/L,pH值7.4，由Sigma公司生产)。

本次评价实验使用的瘦肉精快速检测试纸条/卡从市场上购买。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱质谱仪(由美国安捷伦公司生产)、C18色谱柱(ACQUITY UPLC BEH C18，由Waters公司生产)、电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9420A，由上海一恒科学仪器有限公司生产)、Milli-Q超纯水处理系统(由美国Millipore公司生产)、电子天平(QUINTIX213-1CN，由赛多利斯科学仪器有限公司生产)、振荡器(MMV-1000 W，由上海爱朗仪器有限公司生产)、磁力搅拌器(RCT basic，由IKA公司生产)。

1.3 标准品

克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见表1，纯度≥97%。

表1 3种标准品参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量

1.4 方法

1.4.1 检测人员筛选和培训 评价人员由具有一定检验基础与能力的人员组成,并对其进行快检基本知识、胶体金快速检测技术基本原理和实验技能方面进行培训。为保证评价过程的客观与公正,人员分成2组,一组人员负责盲样的制备与定值,一组人员负责快检产品的测试评价,2组人员互不交叉，另外一组人员则从来没有接触过快检产品。

1.4.2 添加回收实验 为确保仪器验证盲样均匀性实验的准确性，在开展盲样制备之前先做猪肉组织中β-受体激动剂添加回收实验。选取不含瘦肉精的猪肉组织样品，添加克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇标准品，然后用仪器分析，检测其含量，并计量回收率。具体步骤如下：(1)选取空白猪肉样本；(2)制备9个样品，平均分成3组。每组样品中添加不同浓度的标准品，3个浓度水平分别为0.1、0.5、1.0 μg/kg；(3)以GB/T 22286—2008[12]的方法——高效液相色谱串联质谱法，对上述样品进行检测，并计量样品的添加回收率。

1.4.3 盲样制备 根据《食品快速检测方法评价技术规范》[10]，制备盲样的基质应与实际食品样品所含物质相似，本次评价实验所用基质是猪瘦肉。该规范同时对测试水平提出了要求，测试水平一般应包括食品基质空白样品，标准方法检出水平(或者标准限量值)的0.5、1、2倍水平或者其他可检测区分的水平(不少于3个)，或者方法标称检出限0.5、1、2倍水平或者其他可检测区分的水平(不少于3个)。本次评价实验设置4个测试水平，分别为空白样品、≤0.1 μg/kg(阴性样品)、0.5 μg/kg(阳性样品1)、1.0 μg/kg(阳性样品2)。

从市场上购买瘦肉样品，经仪器分析确证，克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇都未被检出，作为空白样品。向猪肉组织中加入克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇及其同位素内标标准品，磁力搅拌器室温条件搅拌12 h，制备成上述4种浓度的样品，再用仪器检测盲样的均匀性和稳定性。

1.4.4 盲样的均匀性和稳定性检验 为保证快检评价实验的准确性和公正性，根据规范“盲样必须进行批内均匀性检查，对于一定时间范围内检测的样品，需要进行稳定性检查，保证在评价期限内样品稳定”。将“1.2.2”节制备的各浓度水平的盲样进行分装(5 g/管)，先用仪器进行均匀性检测，每个样品在重复条件下检测3次。采用单因素方差分析对数据进行统计分析，使用的软件为IBM SPSS Statistics 22(International Business Machines Corporation)，通过F-检验验证样品的均匀性[10]。

将其余样品置-20 ℃储存，分别间隔1周、2周、3周取出，每次取出3个样品，每个样品重复检测3次。依据CNAS-GL003[13]规定，将不同储存时间的检测平均值与初始检测平均值进行一致性比较，以考查样品在评价期内的稳定性。

1.4.5 快检产品稳健性评价与结果统计 实验过程中设置不同的运输温度、湿度、2个存放时间、模拟振动的有无、样品前处理温度设置、不同基质对快检产品结果的影响以及操作熟练程度的影响，设置运输时的温度、湿度、振动等单一因素和多因素交叉复合变量，模拟常规温度的极限条件下的温度(0、35 ℃)条件，用快检产品检测阳性样品，同时用仪器分析结果作为标准参照，统计分析温度因素对最终检测结果的影响。同上，设置2处典型气候的湿度(42%、80%)条件，统计分析湿度因素对最终检测结果的影响。快检产品经过真实的快递线路和摇床模拟振荡，再检测阳性样品，同时以仪器分析结果作为标准参照，分析运输振动因素对检测结果的影响。统计分析运输条件因素对最终检测结果的影响。前处理对样品进行不同温度(80、100 ℃)处理，保持温度和湿度在同一水平考察前处理温度对快检产品结果的影响，不同基质和操作熟练程度操作步骤同上。每组实验设置50个快检产品，最终以阳性率来评价快检产品的稳定性程度。

2 结果与分析

2.1 添加回收实验结果

向阴性瘦肉样品(不含瘦肉精)中添加克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇标准品，添加浓度水平分别为0.25、0.5、1.0 μg/kg，每个浓度水平取3个重复样品，按GB/T 22286─2008进行检测。添加回收实验结果见表2。此添加回收实验的回收率范围为87.7%～112.3%，符合GB/T 27417—2017[14]中“方法回收率偏差范围”。

表2 猪肉组织中克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇的回收率

注：*表示3次重复。

2.2 样品的均匀性检验

按照CNAS-GL003：2018对样品的均匀性和稳定性进行验证。首先对各浓度水平的盲样均匀性进行检测。然后，采用单因素方差分析法(F-检验)对数据进行统计分析，查看GB/T 15000.5─1994[15]的附录B“F检验法临界值表”，SPSS软件分析实验结果的F值，均匀性检测结果见表3、表4。3组浓度水平的F值均小于Fcrit，P值均大于0.05，此结果表明在显著水平α=0.05时，同一浓度水平的所有样品间无显著性差异，即制备的样品是均匀的。

2.3 样品的稳定性检验

盲样制备完成后置于-20 ℃条件下保存，从中取出用于稳定性检测的样品，每次取出3个样品，按GB/T 22286─2008方法进行检测，每隔1周检测1次，每个样品重复检测3次，检测结果见表5。

表3 3种浓度水平样品的均匀性检测结果

表4 测试样品的均匀性分析结果

表5 测试样品的稳定性检测结果

将不同储存时间样品的平均值与初始检测平均值进行一致性比较，按照CNAS-GL003：2018中稳定性检验的要求，采用t检验法“二个平均值之间的一致性”公式计算t值，见表6。查GB/T 15000.5─1994的附录F“T检验法分位数表”，t0.05(37)=2.026，t值都大于2.026，表明各储存时间的检测结果与初始检测结果之间存在显著性差异。但是从各时间段检测结果的平均值表现出变异程度较小。快检产品本身只是对目标化合物做一个初步筛查，对化合物的含量要求不须高度精确。因此，以本研究中的方法制备样品，在短时间内完成快检产品的评价，对评价结果的影响会较小。

表6 测试样品的稳定性分析结果

注：(1)变量1，样品初始的检测结果。变量2，不同时间段稳定性实验检测结果；(2)T1为1周，T2为2周，T3为3周。

2.4 产品的稳定性评价检测与结果统计

本研究从储存温度(0、35 ℃)、湿度(42%、80%)、月份(7月、12月)、模拟振动条件(有、无)、样品前处理加热温度(80、100 ℃)、基质干扰(猪肉组织和尿液)、操作熟练程度(新人、熟练工)等7个方面对快检产品的稳健性进行评价，在设置温度变量时，其他条件保持在同一水平，即湿度在42%，月份为7月，不设振动条件，样品前处理加热温度为80 ℃的猪肉组织，并采用熟练工进行操作，结果见表7。每一组变量分别进行50次平行试验得出阳性率，即检出率。

表7 不同存储条件对快检产品的稳健性评价

注：*样品严格按快检产品说明书进行前处理、检测和判读，平行重复测试50次，得出阳性率。

2.5 结果统计与讨论

通过制备的样品对快检产品进行测试，按照“快速检测方法性能指标计算表”对检测结果进行了统计分析，结果表明：瘦肉精快检产品在温度分别为0 ℃和35 ℃贮存时，检出率为94%和96%，湿度为42%和80%时的检出率为96%、82%，模拟月份在7月和12月的检出率为96%和85%，快检产品在模拟振动和不振动条件下的检出率为93%和96%，样品前处理加热温度分别为80 ℃和100 ℃时的检出率为96%和98%，不同基质样品包括猪肉组织和猪尿液的检出率为96%和88%，不同操作熟练程度的检出率为96%和80%。由上述结果可看出，快检产品在不同的贮存温度和湿度环境下运输对检测结果的影响在15%以上。模拟不同的时间段主要是7月和12月时，检出率95%。使用月份对快检产品的稳定性影响不大。运输过程中的振动有无对快检产品的检测结果影响不大，检出率可达93%。前处理加热温度对快检产品影响较大，样品在前处理过程中加热80 ℃时的阳性率为88%，而100 ℃时的检出率可达95 ℃，可见充分加热处理样品可以将瘦肉精有效的释放，有利于富集浓缩处理液，检出率也更高。同时不同的基质对快检试剂的影响也较大，采用猪肉组织阳性样品进行检测时检出率为81%，而基质为尿液时的阳性率为96%。对不同熟练程度的快检人员使用产品的阳性率也有差异，熟练操作快检产品的人员阳性率可达到96%，而新成员则为80%左右。由此得出猪肉组织温度35 ℃、湿度42%，前处理温度为100 ℃并采用熟练工操作时，样品的检出率高达95%以上，表明快检产品在此条件下的稳定性更高。

3 结论

本研究采用猪肉基质加标的方法制备3种不同浓度水平的瘦肉精样品，对市售胶体金免疫层析试纸条/卡进行评价测试。根据评价结果可知，制备的盲样均匀性良好，由此可以看出快检产品在贮存和运输过程对产品的检测结果具有一定影响，样品的前处理加热条件是影响快检产品稳定性的最大因素，其次是温度和湿度。因此影响快检产品稳健性的因素，由大到小依次为：样品的前处理条件>样品前处理的熟练程度>样品的基质>温度>湿度>快检产品的贮存和运输过程。本文建议在快检产品的使用过程中应该充分考虑快检产品储存运输条件，和使用过程中控制好产品的温湿度同时，采用熟练人员操作产品可以大大提高产品的准确率。