Th17/Treg细胞平衡与感染性早产的关系研究

曹 琦，陈 蕾，李 颖，胡 琼，董生凤

(1.天津中医药大学第一附属医院 产科，天津 西青 300380；2.遵义医科大学附属医院 产科，贵州 遵义 563099)

早产(Preterm birth,PTB)指妊娠满28周至不满37周的分娩[1]。全世界上的发生率约为5%至18%，这是一种常见的妊娠并发症并且有增加趋势[2]。因此，对感染性早产的防治越来越受到大家的关注。研究发现，孕妇体内的免疫细胞可分泌多种细胞因子，构建成母胎界面(蜕膜和子宫组织)复杂的细胞因子网络，维持着母胎免疫平衡[3]。辅助性T细胞17(T helper 17 cells,Th17)和调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)是CD4+T免疫细胞群中重要的细胞亚群，Th17是强有力的致炎细胞，与其所分泌的炎性细胞因子共同参与炎性疾病的发生[2]。Treg细胞在妊娠时可抑制母体对胎儿的免疫杀伤反应，而维持着妊娠的发生发展。本研究对Th17细胞和Treg细胞在感染性早产孕妇外周血中的表达情况进行检测，目的在于探讨其作为早期预测感染性早产发生新指标的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验取材 收集2017年12月至2018年12月遵义医科大学附属医院40例早产(28～36+6周)患者的外周血。这些早产患者产前均无干预措施，年龄、孕前体质量指数(BMI)差异均无统计学意义，具有可比性。根据胎盘病检结果再分为早产感染组(24例)和早产非感染组(16例)。20名正常足月入院的孕妇作为足月待产组，均除外妊娠期合并症及并发症。收集上述3组孕妇静脉血5 mL，肝素抗凝。本研究所有操作均符合医学伦理学，并经遵义医科大学附属医院伦理委员会及患者本人同意。

1.1.2 主要试剂 PE-抗人IL-17A单克隆抗体、FITC-抗人CD4单克隆抗体、APC-抗人CD25单克隆抗体、APC-抗人CD3单克隆抗体、FITC-抗人CD8a单克隆抗体、PE-抗人FoxP3单克隆抗体、PE-鼠lgG1同型对照均购自美国eBioscience公司；Transcription Fsctor Buffer Set购自美国BD公司；PMA+Ionomycin淋巴细胞刺激物、BFA工作液、RPMI1640培养基等。

1.2 方法

1.2.1 白细胞悬液制备 取1mL全血于试管中加入3倍体积红细胞裂解液，震荡摇匀，4℃放置15 min，待细胞裂解。1 500 rpm，离心5 min，弃上清，收集细胞。向白细胞沉淀中加入2 mL红细胞裂解液，1 500 rpm，离心5 min，弃上清，收集细胞。用360 μL PBS重悬细胞。

1.2.2 流式细胞术检测Th17细胞 吸取300 μL全血与同体积RPMI1640培养基，放置于24孔板中。在标本中加入刺激剂和阻断剂，混匀细胞。放置于37℃、5%CO2培养箱中培养刺激4～6 h。流式上样管中分别加入5 μL CD3-APC单克隆抗体、5 μL CD8a-FITC单克隆抗体，吸取200 μL培养好的样本加入流式管中，4℃避光孵育30 min，之后用PBS洗涤细胞2次。加入破膜剂，再次室温避光孵育40～50 min，1 500 rpm，4℃离心6 min，弃上清。重悬细胞后加入5 μL IL-17A-PE单克隆抗体进行充分混匀，并设立对照管，4℃避光孵育40～50 min。用PBS洗涤2次后，加入1%多聚甲醛400 μL固定细胞，于4℃避光保存24 h，FACS calibur流式细胞仪检测，计算CD4+T细胞中Th17细胞所占的百分比。

1.2.3 流式细胞术检测Treg细胞 吸取之前制备的白细胞悬液100 μL加入流式上样管中，分别加入5μL CD4-FITC单克隆抗体、5μL CD25-APC单克隆抗体，涡旋震荡细胞，4℃避光孵育30 min。加入2 mL PBS清洗细胞1次，1 000 rpm，离心5 min，弃上清。加入破膜剂，再次室温避光孵育40～50 min，1 500 rpm，4℃离心6 min，弃上清。重悬细胞后加入5 μL PE anti-Human Foxp3单克隆抗体进行充分混匀，并设立对照管，4℃避光孵育40～50 min。用PBS洗涤2次后，加入1%多聚甲醛400μL固定细胞，避光4℃保存24 h，FACS calibur流式细胞仪检测，计算CD4+T细胞中Treg细胞所占的百分比。

2 结果

2.1 一般临床资料 早产感染组、早产非感染组、足月待产组的年龄、孕次比较差异均无统计学意义，但3组孕周比较差异有统计学意义(P>0.05)，用Pearson简单相关系数分析孕周与外周血中Treg细胞、Th17细胞数量的相关性，结果提示无相关(P>0.05)，可以进行后续实验，详见表1。

表13组孕周与外周血Treg、Th17细胞的相关性

临床指标早产感染组孕周rP早产非感染组孕周rP足月待产组孕周rPTreg0.0120.978-0.1670.7520.0940.811Th17-0.3570.345-0.4630.3550.040.926

2.2 Th17、Treg细胞在外周血中的表达 早产感染组中Th17细胞阳性率明显高于早产非感染组、足月待产组(P<0.01)；Treg细胞阳性率明显低于早产非感染组、足月待产组(P<0.01)；早产非感染组和足月待产组中Th17、Treg细胞阳性率无显著差异(P>0.05，见表2、图1～2)。

组别例数Th17阳性率(%)Treg阳性率(%)早产感染240.640±0.063∗#0.048±0.014∗#早产非感染160.350±0.0490.634±0.136足月待产200.340±0.0980.670±0.109

与早产非感染组相比，*：P<0.05；与足月待产组相比，#：P<0.05。

图1 流式细胞仪检测外周血CD4+T细胞中Th17细胞阳性率

图2 流式细胞仪检测外周血CD4+T细胞中Treg细胞阳性率

3 讨论

在所有不同类型早产中，感染性早产的发生率居于首位，其病因复杂，发病机制不明，是围产儿患病、死亡的重要原因，给家庭及社会带来巨大的心理、社会负担[4]。明确感染性早产的发病机制，针对其发病机制寻找有效的实验预测指标，便于早发现、早诊断、早治疗，对降低感染性早产的发生，具有重要的临床意义。Th17细胞和Treg细胞是近年来新发现的CD4+T细胞亚群，越来越多的证据表明Th17、Treg细胞作为效应细胞和调节细胞参与妊娠的建立和维持，其失衡可能导致妊娠失败[5]。

Th17细胞作为新发现的效应细胞参与妊娠的建立和维持[6]。然而，尚未见报道其对感染性早产的预测作用。本研究中，早产感染组外周血中Th17细胞阳性率表达升高，表明Th17细胞在感染性早产孕妇体内高表达，对妊娠过程中的免疫平衡起到负调节作用。促进中性粒细胞动员、募集、激活，巨噬细胞吞噬病原体等活动一直被认为是Th17细胞发挥促炎作用的主要机制[7]。因而，造成感染性早产的免疫机制可能是：机体被细菌、病毒等病原体攻击后，Th17细胞刺激体内免疫细胞启动免疫应答，导致体内Th17/Treg细胞免疫平衡向Th17细胞方向移动，机体内Th17细胞阳性率增加，促使炎性细胞因子IL-17A表达增多并直接作用于白介素-17受体A(Interleukin‐17 receptor A，IL-17RA)，促进中性粒细胞和巨噬细胞等增殖和成熟，并将其募集到感染部位，通过这些细胞的活化及相关炎性介质释放后形成的炎症级联反应(Inflammatory cascade)，介导外源性细菌感染及促炎作用，提前发动分娩[8-9]。

在本研究中，感染性早产组Treg细胞的阳性率显著低于其它两组，说明Treg细胞在感染性早产孕妇体内表达降低，对妊娠过程中的免疫平衡起积极正调节作用，有利于妊娠维持。其原因可能是：正常妊娠期间，Treg细胞被募集到母胎界面，调节局部抗炎微环境，帮助在母体与胎儿之间形成免疫耐受，维持妊娠的发展[10]。当有微生物侵袭并形成炎症时，炎性介质刺激免疫细胞分化成Th17细胞，使得Treg细胞在免疫细胞中比例降低，细胞外环境中的抗炎细胞因子表达降低[11]。一方面使Treg细胞不能发挥针对胎儿和母体间免疫排斥的高效免疫抑制功能；另一方面，没有足够的抗炎因子来抑制Th17细胞的增殖和分化，无法有效地抑制促炎细胞因子IL-17A等的表达。Th17细胞及其细胞因子将胎儿视为异体移植物或外来病原体发动免疫攻击，这种自身免疫过度，可导致感染性早产的发生。比较3组Treg细胞阳性率，发现非感染性早产和足月分娩孕妇体内表达无明显差异，与Th17细胞阳性率的比较结果相似。进一步表明Th17/Treg免疫失衡确实仅与感染性早产的分娩机制有关，而对非感染性早产和正常分娩的影响微弱。

感染性早产的发生机制目前尚无准确的结论，对其预测及治疗方法有限，本实验通过对Th17、Treg细胞数量的比较，发现当发生感染性早产时，孕妇母胎免疫界面的Th17/Treg细胞平衡发生偏移。因此，对Th17/Treg细胞平衡的动态监测，有望成为预测感染性早产的新指标，但仍需进一步扩大样本量验证。