盐酸氯吡格雷中基因毒性杂质检测方法学研究

王敏

天津红日药业股份有限公司 天津 301700

1 仪器与试药

1.1 仪器

安捷伦1200高效液相色谱仪，VWD检测器。

1.2 试药

对甲苯磺酸甲酯对照品，纯度98%；对甲苯磺酸乙酯对照品，纯度98%。上述对照品均为SIGMA-ALDRICH。色谱甲醇、色谱乙腈均为Fisher公司，试验用水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为ACE 3C18柱（150×4.0mm，3μm）；流动相以0.02mol/L磷酸氢二钾（磷酸调节PH至6.5）-乙腈=7:3为流动相A，乙腈：甲醇=2:1为流动相B，梯度洗脱（0～42min，100%A；42～45min，A100% → 29%；45～55min，29%A；55～75min，100%A）流速1.0ml/min；检测波长225nm；柱温30 ℃；进样量100μl。空白溶剂为50%乙腈溶液。

2.2 溶液的制备

对照溶液的制备：精密称取对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯适量，用50%乙腈溶解并制成每ml含对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯各0.06μg的溶液。供试品溶液的制备：精密称取样品适量，用50%乙腈溶解并制成每ml含盐酸氯吡格雷30mg的溶液。

2.3 检测灵敏度

检测限：精密称取对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯各60mg同置100ml量瓶中，用50%乙腈溶解并定容至刻度；再精密移取0.1ml置100ml量瓶中，用50%乙腈定容至刻度，作为储备液。取储备液42µl置5ml量瓶中，用50%乙腈定容至刻度，作为对甲苯磺酸甲酯的检测限溶液；取储备液83µl置5ml量瓶中，用50%乙腈定容至刻度，作为对甲苯磺酸乙酯的检测限溶液。分别精密量取上述检测限溶液各100µl注入液相色谱仪，记录色谱图，色谱图主峰峰高约为基线噪音的3倍。

结果表明，当供试品浓度为30mg/ml时（折算成进样量为3mg），是对甲苯磺酸甲酯最低检测浓度的约600万倍，是对甲苯磺酸乙酯最低检测浓度的约280万倍，因此供试品中大于0.0002‰的杂质可被有效检出，完全可以满足检测灵敏度的要求[1]。

定量限：取检测限项下储备液167µl置5ml量瓶中，用50%乙腈定容至刻度，作为对甲苯磺酸甲酯的定量限溶液；取检测限项下储备液250µl置5ml量瓶中，用50%乙腈定容至刻度，作为对甲苯磺酸乙酯的定量限溶液。

分别精密量取上述定量限溶液各100µl注入液相色谱仪，色谱图主峰峰高约为基线噪音的10倍，对甲苯磺酸甲酯定量限为2.0ng，相当于样品量0.0007‰；对甲苯磺酸乙酯定量限为3.2ng，相当于样品量0.001‰。

精密量取上述定量限溶液各100µl，连续6次进样，作为定量限精密度溶液，记录色谱图，考察连续进样各次的样品峰面积，计算RSD。结果显示连续6针对甲苯磺酸甲酯峰面积RSD为5.2%，对甲苯磺酸乙酯峰面积RSD为3.5%，定量限精密度良好。

2.4 线性

精密称取对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯各60m g同置100ml量瓶中，用50%乙腈溶解并定容至刻度；再精密移取0.1ml置100ml量瓶中，用50%乙腈定容至刻度，作为储备液。取储备液 250µl、335µl、400µl、500µl、600µl、750µl、1ml分 别 置 5ml量瓶中，用50%乙腈定容至刻度，制成一系列的线性溶液。取上述溶液各100µl注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标进行线性回归，求出线性方程和相关系数。实验结果表明：对甲苯磺酸甲酯浓度在0.03µg/ml～0.12µg/ml之间，线性方程y=337.8x+1.1484，R2=0.9994，峰面积与浓度呈良好线性关系。对甲苯磺酸乙酯浓度在0.03µg/ml～0.13µg/ml之间，线性方程y=346.75x-1.1931，R2=0.9994，峰面积与浓度呈良好线性关系。

2.5 系统适用性/重复性

精密称取对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯各60m g同置100ml量瓶中，用50%乙腈溶解并定容至刻度；再精密移取0.1ml置100ml量瓶中，用50%乙腈定容至刻度，再取1ml置10ml量瓶中，用50%乙腈定容至刻度，制成系统适用性溶液。取上述溶液100µl连续进样6次，记录色谱图，考察连续进样各次的样品峰面积，计算RSD。

实验结果：系统适用性溶液连续6次进样结果表明对甲苯磺酸甲酯6针峰面积RSD为2.1%、对甲苯磺酸乙酯6针峰面积RSD为2.3%，说明该方法系统适用性良好，且方法的重复性良好。

2.6 回收率

取盐酸氯吡格雷及对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯对照品，均按限度浓度的80%、100%和120%进行加样回收率试验，每个浓度配制3份样品。实验结果表明：对甲苯磺酸甲酯的加样回收率在84～96%之间，平均回收率为 90.5%，RSD=3.7%，对甲苯磺酸乙酯的加样回收率在96～113%之间，平均回收率为104.7%，RSD=5.8%，回收率较好。

2.7 耐用性

分别考察了不同柱温、不同检测波长、不同流速、不同流动相PH对检测结果的影响，结果如下：

正常条件：采用C18柱（150×4.0mm），以0.02mol/L磷酸氢二钾（磷酸调节PH至6.5）-乙腈=7:3为流动相A，乙腈：甲醇=2:1为流动相B，检测波长为225nm，柱温30℃，流速1.0ml/min，进样量100μl，采用梯度洗脱。空白溶剂：50%乙腈溶液。对照溶液的制备：精密称取对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯适量，用50%乙腈溶解并制成每ml含对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯各0.06μg的溶液。供试品溶液的制备：精密称取样品适量，用50%乙腈溶解并制成每ml含盐酸氯吡格雷30mg的溶液[2]。

不同检测波长：将检测波长变更为220nm和230nm，其余色谱条件同正常条件进行检测。实验结果表明检测波长改变后，检测结果无明显变化，方法耐用性良好。

不同柱温：将柱温变更为25℃和35℃，其余色谱条件同正常条件进行检测。实验结果表明柱温改变后，对甲苯磺酸甲酯及对甲苯磺酸乙酯的出峰时间有所变化，但对检测结果无明显影响，方法耐用性较好。

不同流速：将流速变更为0.9ml/min和1.1ml/min，其余色谱条件同正常条件进行检测。实验结果表明流速改变后，对甲苯磺酸甲酯及对甲苯磺酸乙酯的出峰时间有所变化，但对检测结果无明显影响，方法耐用性较好[3]。

不同流动相PH值：将流动相A的0.02mol/L磷酸氢二钾分别用磷酸调节PH至6.4和6.6在与乙腈按7:3混合，其余色谱条件同正常条件进行检测。实验结果表明流动相PH改变后，对甲苯磺酸甲酯及对甲苯磺酸乙酯的出峰时间有所变化，但对检测结果无明显影响，方法耐用性较好。

3 结语

基因毒性物质是指能直接或间接损害DNA，导致基因突变或癌症的物质。基因毒性物质对DNA的损害作用包括染色体断裂、DNA重组、DNA复制过程中共价键结合或插入，也包括通过激活细胞产生基因毒性物质而产生的突变。近年来有关药物中的基因毒性杂质的控制得到来自于药物监管部门与药物研发机构的高度重视，基于风险管理的阶段化TTC控制策略，使得基因毒性杂质的控制更趋科学合理。TTC概念的应用允许在无任何体内数据时，在足够的安全性基础上建立杂质控制限度。TTC概念的应用有利于患者、企业和监管机构，使他们避免做不必要的毒理研究和安全性评估。欧洲药典委员会认为一个产品在接受市场监管的时候，应该对可能存在的基因毒性杂质进行评估，这是建立一个新产品各论的基本要求。磺酸酯作为一类较为常见的基因毒性杂质，可以通过对关键工艺参数的优化与设计进行有效控制，符合当下“质量源于设计”的理念，即良好的工艺设计往往能促进高质量药物的生产，并在充分保障药物安全性的基础上尽可能减少企业的研发投入及相应的政府监管成本。