液质联用测定土壤中的兽药残含量的方法改进

陈永锐，伍爱梅

液质联用测定土壤中的兽药残含量的方法改进

陈永锐，伍爱梅

（广东中蓝检测技术有限公司，广东 佛山 528000）

土壤中的兽药残留含量是衡量土壤污染程度的一个重要标准。目前测定土壤中兽药残留含量的常用方法是液质联用法，但传统的液质联用法存在操作困难、检出量较大的缺点。实验通过固相萃取和梯度洗脱的方法对传统的液质联用法进行了改进，改进后检出范围均为0.1～500 μg/L，同时还具备灵敏度高、操作简易、重现性好的特点，可以满足对土壤中兽药残留含量的检测要求。

兽药；四环素类抗生素；液质联用；固相萃取

兽药残留通常指给动物使用药物后蓄积和贮存在细胞、组织和器官内的药物原形、代谢产物和药物杂质。在现代社会，由于畜牧业的飞速发展，现代化、集约化和规模化的生产方式已经成为了当今中国畜牧业发展的主流。常见的兽药残留有抗微生物药物（抗生素和化学合成抗菌素的统称）、抗寄生虫药、生长促进剂和杀虫剂等。抗微生物药物是最主要的兽药，添加剂和兽药残留占药物添加剂总量的60%左右，而这其中四环素类抗生素（土霉素、四环素和金霉素）由于价格低廉且具有较强的杀菌抗炎效果而被广泛应用于畜牧养殖行业。而未被吸收分解的四环素类抗生素会以粪便或尿液的形式排出体外，四环素类抗生素在自然环境中分解缓慢因而会导致土壤污染。为了检测饲养场粪便处理厂附近的土壤中的情况，就需要对其土壤进行检测。四环素类抗生素等兽药残留属于微量至超微量的分析范畴，这对于仪器及分析方法都有较高要求。目前，常用的测量土壤中四环素类抗生素的方法是液质联用法，本文对传统的液质联用法进行了改进。

1 实验部分

1.1 实验仪器

实验仪器主要有：Agilent LC/MSD Trap XCT型电喷雾离子阱质谱搭配Agilent1100超高效液相色谱仪、JIUPIN-COS-2403CL恒温震动摇床、JIDI-20R台式多用途高速冷冻离心机、超声波清洗机。

1.2 试剂与材料

本次实验试剂、材料规格及产地如表1所示。

1.3 实验准备

1.3.1 EDTA缓冲溶液的配置

首先将1 L质量浓度为0.1 mol/L柠檬酸溶液与0.625 L质量浓度为0.1 mol/L磷酸氢二钠溶液相混合，然后加入0.5 L质量浓度为0.1 mol/L的EDTA溶液，调节pH至4.0左右。

表1 试剂与材料规格及产地表

名称规格产地 乙腈色谱纯中国医药集团有限公司 甲酸色谱纯中国医药集团有限公司 乙二胺四乙酸二钠优级纯中国医药集团有限公司 三氯乙酸优级纯中国医药集团有限公司 柠檬酸优级纯中国医药集团有限公司 磷酸氢二钠优级纯中国医药集团有限公司 土霉素纯物质安谱 四环素纯物质安谱 金霉素纯物质安谱

1.3.2 土壤的采集

本实验检测的土壤为浙江省湖州市安吉县某年出栏量为500头左右的小型养猪场的粪便处理池附近的种植耕地，这些种植耕地每年都会施加两三次该厂区粪便（已连续5年以上）。本次在此种植地随机取样，取样点分别采取地表层土壤（0～20 cm处）样品和亚表层土壤样品（20～40 cm处），同时采集该地区远离粪便处理区且从未施加过粪便的土壤作为空白样。

1.3.3 土壤的处理

由于土霉素、四环素和金霉素均属于高极性的弱酸弱碱化合物，易与蛋白质结合，因此本实验分别采用三氯乙酸和EDTA来提取土壤中的这些物质。

分别称取土壤样品5 g置于锥形瓶中，加入20 mL的EDTA缓冲溶液，充分震荡后取上层提取液，重复3次后，将3次提取的上层提取液加入体积分数为10%的三氯乙酸0.5 mL，混均静置后，置于离心机，8 000 r/min的条件下离心5 min。取上清液利用固相萃取柱（HLB小柱）对其进行富集，乙腈洗脱，氮吹至近干，用初始流动相（10%乙腈、0.1%甲酸溶液）定容1 mL，过膜待测。

1.3.4 标准溶液的配置

用初始流动相（10%乙腈、0.1%甲酸溶液）配制四环素、土霉素和金霉素的混合标准母液，再稀释得到标准曲线浓度分别为0.1 μg/L、0.5 μg/L、1 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、50 μg/L、250 μg/L、500 μg/L的标准溶液。

1.4 液相色谱-质谱检测的条件

使用 LC-MS/MS 法测定土壤中四环素类抗生素残留量。超高效液相色谱的色谱柱为ACQUTTY HPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱温为35 ℃，进样量为5 μL，流速为0.2 mL/min，其流动相为乙腈和0.1%甲酸溶液，进行梯度洗脱，程序如表2所示。

表2 梯度洗脱程序

时间/min流速/（mL/min）流动相A/（%）流动相B/（%） 00.21090 1.50.21090 30.25050 40.29010 5.50.29010 90.25050 120.21090

液相色谱所串联质谱仪使用电喷雾离子源（ESI），离子源温度为120 ℃，脱溶剂温度为350 ℃，脱溶剂气和锥孔气为氮气，脱溶剂气流速为600 L/h，锥孔气流速为50 L/h，碰撞气为高纯氩气，采用多反应监测模式（MRM）检测，测定使用ESI正离子模式，进样量5 μL。

2 结果与讨论

在上述实验条件下对配置的标准溶液进行测定，绘制标准溶液曲线。本实验的土霉素、四环素和金霉素的检出范围均为0.1～500 μg/L，在该范围标准曲线均呈现出较强的线性相关，色谱的峰型较为尖锐，其线性相关系数的值均大于0.998 9，仪器重现性RSD均小于1%。以此为样品对土壤样品进行检测，其结果如表3所示。

实验结果表明：粪便处理池附近的种植耕地的土壤样品中的四环素类抗生素含量较高，土壤亚表层的四环素类抗生素为土壤表层1/3～1/2的水平。

远离粪便处理区且从未施加过粪便的土壤仍检测出四环素类抗生素，这说明四环素类抗生素可能具有很强的环境迁移性，需要引起相关部门的注意。

表3 土壤样品中的土霉素、四环素和金霉素含量情况

样品名土霉素含量/（μg/kg）四环素含量/（μg/kg）金霉素含量/（μg/kg） 样品A 表层342425167 样品A亚表层15613299.9 样品B表层43.611.215.4 样品B亚表层15.98.453.56

注：粪便处理池附近的种植耕地的土壤样品为样品A，远离粪便处理区且从未施加过粪便的土壤为样品B。

3 实验结论与展望

为了简便、准确地检测出土壤中的兽药残留含量，为土壤实时检测提供依据，本实验以土壤中兽药残留含量最高的四环素类抗生素为例，通过固相萃取、梯度洗脱的方法对液质联用测量土壤中四环素类抗生素含量的方法进行了改进。此改进方法既可以提高对土壤中的兽药残留的提取效率，又可以准确定性土壤中兽药残留物质，检出范围均为0.1～500 μg/L，且具有较好的重现性，还具备灵敏度高、操作简易的特点，可以满足土壤兽药残留含量检测的要求。

本实验改进了一种通过液质联用测定土壤中兽残含量的方法，这将大大提高兽药残留物组分的测量精度和速度。但仅有测量方法还不够，解决兽药残留的根本还在于制订相应的法律法规，严格规范兽药的安全生产和使用，同时，还要加大宣传，学习和借鉴国外先进的饲养管理技术，合理使用兽药。

［1］勾新磊，刘伟丽，高峡，等.液相色谱-串联质谱技术在食品药品安全分析领域的应用［J］.食品安全质量检测学报，2016（11）：4283-4288.

［2］张志强，李春花，黄绍文，等.土壤及畜禽粪肥中四环素类抗生素固相萃取——高效液相色谱法的优化与初步应用［J］.植物营养与肥料学报，2013，19（3）：713-726.

TS207.3

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2019.15.049

2095－6835（2019）15－0120－02

〔编辑：张思楠〕