水体微生物检测技术研究与应用进展

贾 伟

(江西师范大学 地理与环境学院，江西 南昌 330022)

1 水体微生物

微生物是人类迄今发现的最早和分布最广的生物类群，它个体微小，种类繁多,在人类的生活中发挥着重要作用，它主要包括微生物、病毒以及一些小型的原生生物等[1]，微生物通过对自然界环境演变过程的影响和微生物自身的进化从而对地球的化学循环过程、区域气候的演变、动植物的进化造成影响[2]。微生物积极参与自然界的物质循环和能量流动并起到了积极地推动作用[3]，微生物在水生生态系统中同样不可或缺，水体中复杂的难分解的有机物在一定程度上可以依靠微生物进行降解处理,从而起到净化水质和保护水生生态系统良性循环的作用[4]。在环境生态学、自然地理学等多学科领域，微生物都是重点研究对象，在生态系统中关注微生物群落的分布特征及其与环境因子之间的关系,有助于人们理解自然中复杂的生态系统结构微生物,为水生生态系统的健康、水域环境的保护提供依据[5]。

2 水体微生物检测技术

2.1 微生物分离培养法

使用最早、最基础的微生物培养技术就是利用微生物的遗传特征、生理功能特征、形态特征对菌种进行培养、计数、分离和鉴定，通过这种方法可以对微生物的多样性或者某种群的生物定量进行分析。Uta Bockelmann等[6]使用微生物传统分离培养法对德国的Elbe河流进行了微生物多样性的研究，结果表明春季河水中微生物多样性高于秋冬季节。

随着微生物检测技术的发展，传统的分离培养法局限性越来越大，通过培养的得到的微生物种类在自然界占据的比例很小，目前已知的可被培养的微生物种类不超过5000种，在淡水中只有大约0.25%的微生物可以进行培养[7],因此传统的微生物分离培养法已无法应对复杂的河流微生物群落的多样性分析，无法真实的反映河流中微生物的群落结构和分布规律。

2.2 分子生物学技术

近10年间，微生物的研究技术发展迅速且更加的商业化，如高通量测序技术、单细胞水平研究法和宏组学基因等技术手段对微生物检测的成本和准确度都有了很大的提高。与传统的分离培养方法比较来说，分子生物学技术以特定的核酸片段为生物标记物，对样品直接进行DNA和RNA提取，并以此来分析环境微生物的结构组成和多样性，将提取的DNA进行PCR扩增后得到PCR产物，通过高通量测序、微列阵等技术手段分析环境微生物的组成的多样性。PCR扩增的目标片段可以选择如16sRNA、18sRNA或者ITS区等。

2.3 变性梯度凝胶电泳和末端限制性片段和长度多态性

变性梯度凝胶电泳技术(DGGE)是将特定的的DNA片段在聚丙烯酰胺凝胶中按照从低到高的线性变性梯度进行电泳，是很理想的分子标记法，在对相对丰度大于1%的优势微生物种群分析时应用比较广泛[8]。刘乐冕[9]等通过变性梯度凝胶电泳技术对厦门后溪流域浮游微生物群落空间分布格局进行分析发现该流域的优势类群为变形菌门，占比达到了40%。变形菌门中以γ-Proteobacteria为主，

2.4 高通量测序

高通量测序又名二代测序技术，与传统的桑格测序(Sanger)相比，高通量的测序深度更好、输出量更高。以微生物目标基因的PCR产物为样本进行测序，每次能测得几万甚至几百条有效序列。二代测序技术不仅能从微生物群落的水平上揭示微生物组成的变化还可以从门、纲、目、科、属、种等具体的分类水平上反映微生物组成分布的具体变化，除了应用在16sRNA等多样性分析中还可以应用在功能性基因分析中。Hermann-bank等[10]使用二代测序技术对多瑙河水体微生物的组成和丰富度进行了分析。

2.5 宏基因组学和宏转录组学

微生物基因组和转录组就是不进行PCR扩增，将目标片段随机测序后得到全面的微生物遗传信息的技术也叫鸟枪测序法，与16sRNA相比，除了包含微生物群落的分类信息之外，更包括了所有微生物的基因信息，可以更好反映微生物群落的结构、分布、功能等，在处理基因组学这类项目时，计算机所需要的硬件和数据处理资源比较大，Web Carma，MG-RAST，Galaxy和 Gene Pattern等工具已经被广泛的应用在了宏基因组数据处理的问题上。

随着测序技术的不断发展，宏组学在微生物研究中已经被广泛使用，目前主要应用在土壤、河流、湖泊海洋等生态系统。

2.6 单细胞水平研究方法

单细胞水平的研究可以将微生物从单细胞水平揭示其代谢活性和差异等信息，帮助人们更好的了解微生物群落的分布规律、群落结构等。目前这种研究方法只能应用于相对简单的环境，如水体、纯培养微生物或者富集微生物等。Musat 等[11]对寡营养湖水的闪囊、奥氏着色菌和泥生绿菌对无机碳和氮的吸收特征的研究时发现丰富度较低的奥氏着色菌对该湖水的碳氮循环过程有着重要影响。

3 结语

微生物数量巨大，在整个生态系统中占据着重要作用，它们直接参与碳、氮、磷、硫和一些金属的生物地球化学循环、加快污染环境修复进程等，在物质循环和能量流动之间发挥着不可替代的的作用。水体微生物因在水域生态系统的物质和能量代谢中起到重要作用而成为各种环境因子以及水污染的重要指示物。生态因子的变化相应的就会引起水体微生物群落结构的变化，研究水体微生物的分布及其影响因素的互相作用，对水域生态学研究有重要的意义。近年来，传统微生物分离培养方法的局限性促使分子生物学得到快速发展，能够快速准确的获得样品中的微生物群落的组成，为环境微生物的时空特征研究提供了方法支持。