羔羊致病性沙门菌分离鉴定与药敏试验

王恒月

(湖北省兴山县高桥乡畜牧兽医中心,湖北 兴山 443715)

2018 年3 月,南京地区某养羊场,35 日龄的羔羊出现精神沉郁、厌食、排出黏性带血恶臭的粪便、腹泻2～3 d 后出现死亡。为了研究引起羔羊死亡的病原菌,无菌采集病死羔羊的肝脏、肠内容物等病料组织分离出1 株沙门菌,因此对分离沙门菌进行致病性、耐药性研究。为沙门菌引起羔羊腹泻的防治提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源 2018 年3 月,南京地区某养羊场无菌采集病死羔羊的肝脏、肠内容物等病料组织。

1.2 主要试剂 S.S.培养基、普通琼脂培养基、营养肉汤、革兰染色试剂盒,购自北京华越洋生物技术有限公司;肠杆菌科生化鉴定条、药敏纸片,均购自北京天坛药物生物技术开发公司;DL-2 000 Marker、2×TaqMarker Mix,均购自北京康为世纪生物科技有限公司;7%绵羊脱纤血液琼脂培养基由本实验室自制,常规的试剂及仪器由本实验室提供。

1.3 实验动物 25±2 g 体重昆明系小鼠10 只,由南京农业大学动物实验中心提供。

1.4 细菌分离与培养 将采集的病死羔羊的肝脏、肠内容物等病料组织接种于鲜血琼脂培养基,37 ℃培养12 h～16 h,选取单个优势菌接种于S.S.琼脂培养基上,37 ℃培养12 h～16 h 后,挑取单个菌落接种营养肉汤中进行纯化培养,取纯化培养分离菌株革兰染色镜检观察细菌形态学。

1.5 细菌的生化鉴定 按照说明书将纯化的分离菌株接种于肠杆菌科生化鉴定条中,37 ℃培养18 h～24 h 后,用ATB 自动生化鉴定系统对分离菌株进行细菌的生化特性鉴定。

1.6 细菌的16S rRNA PCR 扩增与测序 用水煮法提取分离菌株的DNA 基因组,设计细菌16S rRNA 通用引物27F 5′-CCGTCTTCAGTTCCAGTGTG-3′,1492R 5′-GTGGCGGACGGGTGAGTAA-3′由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。对分离菌株用降落PCR扩增与鉴定。PCR 反应体系与条件,2×TaqMix 12.5 μL,Primer Mix(10 μmol/L)各1 μL,DNA 模板各2 μL,ddH2O 补至25 μL;95 ℃5 min;95 ℃30 s,58 ℃30 s,72 ℃30 s,循环35 次;72 ℃10 min。将分菌株的PCR 产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,测序结果与GenBank 中登录参考基因序列进行同源性分析。

1.7 细菌致病性试验 将10 只昆明系小鼠随机分为2 组,试验组每只小鼠通过灌胃的方式攻毒0.25 mL(108CFU/mL),对照组给予等量的无菌生理盐水。在攻毒12 h 后,观察6 d,并记录试验组小鼠的发病与死亡,对于死亡的小鼠进行细菌学分离鉴定。

1.8 药敏试验 按照美国临床检验标准委员会(NCCLS)推荐的标准K-B 纸片法进行试验操作和结果判断。

2 结果

2.1 细菌分离培养与形态学结果 在血液琼脂培养基上长出了白色、光滑湿润、边缘整齐的大小一致的菌落;在S.S.琼脂培养基上长出了光滑、圆形、灰白色中间带有黑心的菌落;普通培养基上长出湿润的小菌落。革兰染色镜检可见分离菌株呈散在的革兰阴性短杆菌,无荚膜和芽孢。

2.2 细菌生化试验结果 分离菌株能发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、枸橼酸盐,产酸不产气;不发酵蔗糖、尿素、酵乳糖;V-P 试验、吲哚试验呈阴性,产生H2S;分离菌株用ATB 自动生化仪鉴定为沙门菌,评定结果合格率在98.9%～99.9%之间。

2.3 细菌的16S rRNA PCR 扩增与测序 分离菌株用细菌16S rRNA 通用引物进行PCR 扩增,结果显示,分离菌株扩增出大约1 492 bp 的目的条带(见图1),分离菌株测序结果与GenBank 数据库中登录的10 株沙门菌参考菌株基因序列同源性在99.9%～100.0%之间。从分子生物学基础证实了分离菌株为沙门菌。

图1 分菌株PCR 扩增结果

2.4 致病性试验结果 试验组小鼠在攻毒后的24～48 h,小鼠出现精神沉郁、厌食,3 只小鼠严重腹泻症状,至试验第4 天,试验组的小鼠全部死亡。剖检死亡的小鼠,无菌采集肝脏进行分离鉴定,结果显示,在死亡的小鼠的体内分离到沙门菌,对照组小鼠健康存活,因而证实分离菌株为致病性沙门菌。

2.5 药敏试验 药敏试验结果见(表1),分离菌株对头孢曲松、头孢噻肟、恩诺沙星、氟苯尼考、阿米卡星5 种药物高度敏感;对环丙沙星、头孢他定、大观霉素、多粘菌素4 种药物中度敏感;对氨苄西林、阿莫西林、庆大霉素、新霉素、多西环素、林可霉素、青霉素7 种药物耐药。

表1 药敏试验结果

3 讨论

沙门菌是一种人兽共患的条件性病原菌,是引起多种家畜家禽及人腹泻的重要病原菌之一,该菌通过消化道、呼吸道等多种途径感染宿主,感染宿主后该菌在动物的肠道内进行定植、生长、繁殖,产生大量的毒素,造成严重的腹泻,产生的毒素再通过动物的肠道上皮细胞进入体内,血液循环进入全身的组织器官,引起动物的菌血症,严重的出现败血症[1]。带菌动物和隐形感染的动物是沙门菌主要的传染源,可以长期带毒和排毒,该菌可以通过水平传播方式传播,因此,导致沙门菌病广泛发生与流行[2]。喻华英等[3]报道了在腹泻致死的羔羊体内分离出致病性沙门菌。本试验研究显示,从35 日龄的腹泻羔羊中分离出1 株沙门菌,致病性试验显示,分离株具有很强的致病性。沙门菌是一种条件病原菌,当外界条件改变时,如冷热交替、突然换料、卫生条件较差等应激因素,可以致使羊机体防卫机能下降,引发沙门菌病的发生与流行,在养羊过程中应引起重视。

沙门菌具有多种血清型,并易产生耐药性,该菌的耐药性在不同菌株及不同血清型之间传播,对不同菌株造成严重耐药性,该菌的耐药性可以多种途径传播给人类,给人类的健康造成严重的威胁[4]。本试验结果显示,分离菌株对头孢曲松、头孢噻肟、恩诺沙星等5 种药物高度敏感;对环丙沙星、头孢他定、大观霉素等4 种药物中度敏感;对氨苄西林、阿莫西林、庆大霉素等7 种药物耐药。江萍等报道了分离的沙门菌对诺氟沙星、卡那霉素、阿莫西林、氨苄西林、氟苯尼考、四环素等药物耐药性严重[5]。当发生该病时,应进行药敏试验选择敏感药物,合理用药,提高治疗效果。同时加强平时的饲养管理和注意环境的消毒,减少环境的诱因。