高原牧区羊黑疫野毒分离株的生物学鉴定及免疫原性分析

李生庆,张西云,李淑萍,胡国元,王亭亭,刘怀新,叶明俊,贾 苗

(1.青海大学畜牧兽医科学院,青海 西宁810016;2.青海大学农牧学院动物医学系,青海 西宁 810016)

诺维氏梭菌(Clostridium Novyi),是一种广泛分布于自然界中的条件性致病菌,是革兰染色阳性、两端钝圆的粗大杆菌。本病主要发生在肝片吸虫流行的低洼潮湿地区。本病的发生经常与肝片吸虫感染密切相关[1],主要集中在4 月份和9、10 月份,青海省海北州海晏县和海西州乌兰县近几年连续报道了由B 型诺维氏梭菌引起的大量羊只急性死亡[2-3],目前该病已广泛分布于世界各地,严重危害各国养羊业的发展。

目前,对于该病主要采取疫苗免疫预防为主,然而,在本省曾多次发生免疫羊只发病的现象,我们推测可能是疫苗免疫原性及免疫保护不够导致羊黑疫的连续发生,为了提高羊黑疫疫苗的免疫保护力,我们从青藏高原牧区病死羊体内分离的5 株野毒株中筛选具有高免疫原性的B 型诺维氏梭菌菌株,并进行16S rRNA 分子鉴定及菌株系统进化树构建,通过产毒试验及免疫试验,筛选出具有代表性的1 株TB05 野毒菌株,研制成地方菌株羊黑疫菌苗,家兔及本动物免疫试验证明,该菌具有良好的培养特性及免疫原性,可替代现有制苗用菌株。本试验对高原牧区放牧绵羊羊黑疫的预防控制起到至关重要的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 TB05、WB1、S6、G4、HF 地方分离菌株均由本实验室分离保存;C614,购自中国兽医药品监察所。

1.1.2 试剂 细菌基因组DNA 提取试剂盒及质粒提取试剂盒,购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.1.3 实验动物 昆明系小鼠,体重16～18 g,购自青海省地方病研究所小动物繁殖基地;试验家兔,体重2～3 kg,购自青海省互助县家兔养殖基地;试验羊,体重20～25 kg,由青海省海北州顺仓牛羊繁育基地提供。

1.2 方法

1.2.1 菌株培养 将6 株B 型诺维氏梭菌接种于加生肝块的自制VF 培养基中,37 ℃培养72 h,抹片镜检。

1.2.2 B 型诺维氏梭菌基因组DNA 提取、PCR 扩增及序列分析 基因组DNA 提取：取1.2 mL 上述7 株B 型诺维氏梭菌48 h 纯培养物于1.5 mL 离心管中,12 000 r/min 离心1 min,弃取上清液,按DNA提取试剂盒要求提取基因组DNA。

基因组16S rRNA PCR 扩增：采用16S rRNA 通用引物P1 和P2,引物序列分别：P1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;P2：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。以提取的7 株诺维氏梭菌基因组DNA 为模板进行PCR 反应。PCR 反应 在50 μL体系中进行,扩增条件为：95 ℃5 min、95 ℃30 s、54 ℃45 s、72 ℃1 min,30 个循环后,72 ℃延伸10 min。

PCR 扩增产物回收：利用OMEGA 公司购买的Gel Extraction Kit 按说明书提取目的片段,电泳检测后送样测序。并采用DNASTAR 软件对基因序列进行同源性分析。

1.2.3 系统发育树的构建 通过NCBI 提供的BLAST 在线搜索服务软件获取其他产气荚膜梭菌(魏氏梭菌、B 型诺魏氏梭菌)16S rRNA 基因组核酸序列。使用MEGA5.0 软件的系统发育树构建功能对基因序列进行分析,选择邻近法构建系统发育树,分析不同分离株诺维氏梭菌基因间的进化关系。

1.2.4 诺维氏梭菌α 毒素基因的PCR 扩增 根据GenBank 公布的B 型诺维氏梭菌α 毒素基因序列而设计一对引物P3 和P4,引物序列分别为：P3：5′-AAATTCAAGGAGGAATTTTA-3′;P4：5′-TTATGCTAACTTTAGCTGCGTC-3′;以提取的诺维氏梭菌基因组DNA 为模板进行PCR 反应。PCR 反应在50 μL 体系中进行,扩增条件为：94 ℃5 min、94 ℃1 min、58 ℃45 s、72 ℃1.5 min,30 个循环后,72 ℃延伸10 min。

1.2.5 菌种毒力测定 将上述经VF 培养基适应的6 株菌接种于未加生肝、含1.0%糖的VF 培养基中,37 ℃培养72 h,抹片、镜检,抽样,4 000 r/min 离心20 min,递倍稀释后,小鼠静脉注射测定毒力。

1.2.6 TB05 地方菌株菌苗的制备及免疫效果检测 羊黑菌苗制备：利用高产毒TB05 地方菌株及C614 标准株进行大瓶培养,72 h 后,按0.5%剂量加入甲醛,置于37 ℃杀菌、脱毒72 h,经无菌检验后,按菌液5 份+铝胶1 份(每毫升菌苗含氢氧化铝为7 mg 的量),充分混合,分装待用。

家兔免疫攻毒试验及血清抗体效价测定：取体重1.5～2.0 kg 健康兔44 只,分别用上述两种自制疫苗免疫家兔0.1 mL、0.5 mL,每组皮下注射家兔4 只,免疫21 d 后,耳静脉采血分离血清、并按家兔最小致死量300 MLD/mL(小鼠静脉注射)攻毒,记录死亡情况。

本动物免疫试验：利用上述两种疫苗各2 mL皮下注射绵羊10 只,羊只免疫21 d 及1、2、3 个月及6 个月后,颈静脉采血3～5 mL,4 ℃冰箱过夜,待血清析出后,按组别吸出血清待用,测定血清效价。

2 结果

2.1 菌株形态观察 在VF 培养基中,37 ℃培养24 h,革兰染色呈阳性,菌体两端钝圆,呈粗杆状(见中插彩版图1);培养72 h 可见芽孢体。在含1.0%葡萄糖、pH 值8.4～8.6 的VF 培养基中,37 ℃培养48 h,显微镜下为错粗大的梭状芽孢体(见中插彩版图2)。

图1 常规培养下的菌体形态

图2 特殊培养条件下的菌体形态

2.2 诺魏氏梭菌基因组16S rRNA 基因扩增与序列分析结果

2.2.1 PCR 扩增结果 6 株产气荚膜梭菌获取的菌体DNA 经16S rRNA 通用引物PCR 后扩增,1.5%琼脂糖凝电泳检测,结果显示,6 株菌均在1 450 bp 处出现条带,与预期的片段大小一致(如图3 所示)。

图3 5 株地方分离菌株及标准株16S rRNA 扩增结果

2.2.2 基因组序列测定与同源性比较 将PCR 扩增得到的产物送北京赛百盛基因技术有限公司测序。并利用DNAStar 软件将得到的序列与GenBank公布的B 型诺维氏梭菌参考毒株进行比对,并进行同源性分析,结果表明,其中的5 株菌的基因与参考菌株(Clostridium novyi)基因高度同源性均在99.5%以上(见图4)。

图4 基于B 型诺魏氏梭菌地方分离菌株16S rRNA 基因的系统进化树

2.3 诺魏氏梭菌α 毒素基因的PCR 扩增结果 利用设计的B 型诺维氏梭菌α 毒素特异性引物,并以6 株菌获得的DNA 为模板,采用PCR 扩增得到α毒素基因。从图5 可以看出,PCR 产物α 毒素基因大小为530 bp,与实验设计相符,说明6 株菌均为B型诺维氏梭菌。

2.4 菌种毒力测定 6 株B 型诺维氏梭菌在同一培养条件下的产毒素能力如图6 所示,其中TB05地方菌株产毒能力最高,平均可达40 000 MLD/mL,与其他菌株的产毒能力差异极显著(P＜0.01)。

2.5 菌苗免疫效力检验

2.5.1 免疫家兔血清抗体效价测定 TB05 磷酸铝苗0.5 mL 免疫组0.1 mL 血清最高可中和300 个MLD(小鼠最小致死量),而对照组最高只能中和100 个MLD;TB05 磷酸铝苗0.1 mL 免疫组0.1 mL血清最高可中和200 个MLD(小鼠最小致死量),而对照组最高只能中和100 个MLD(见图7)。

图5 5 株地方分离菌株及标准株α 毒素PCR 扩增结果

图6 不同菌株的产毒素能力对比

图7 两种菌苗免疫家兔体内血清抗体效价比较

2.5.2 绵羊免疫血清抗体测定结果 免疫21 d 后,0.1 mL 血清可中和大于400 MLD/mL(小鼠最小致死量),免疫180 d 后0.1 mL 血清仍可中和50 MLD/mL。而对照组免疫21 d 后,0.1 mL 血清只能中和大于50 MLD/mL(小鼠最小致死量),在3 个月后,基本无保护效力,差异显著(见图8)。

图8 免疫羊体内血清抗体效价变化

3 讨论

疫苗制备过程中,高产毒菌株的筛选至关重要。本研究先通过对青藏高原牧区病死羊病料中分离的B 型诺韦氏梭菌进行细菌生物学特性分析,分析了a 毒素基因序列并构建了16S rRNA 的系统进化树,系统发育树表明5 株地方菌株与标准菌株C614 相距很近,说明亲缘性非常高。之后通过大量的试验,比较5 株病原菌株的致病力差异,产毒量差异,最终筛选出产毒量最高培养稳定、免疫原性好的TB05 菌株作为疫苗候选株。

在由产气荚膜梭菌所引起的众多家畜“猝死症”的研究报道中,外毒素一直被认为是致动物死亡的主要原因之一[4]。B 型诺维氏梭菌α 毒素是造成动物死亡的主要毒素,在20 世纪中叶,很多科研工作者开始致力于探索疫苗接种用于预防产气荚膜梭菌病的可能性。α 类毒素的研究始于20 世纪30 年代,大约在二战时期达到顶峰[5]。此种病的免疫关键在于动物体内抗毒素水平的高低,因此在生产B 型诺维氏梭菌灭活疫苗时,首先要求制苗菌液中毒素的毒力达到一定标准,才能得到高效疫苗,获得良好的免疫效果。本研究对分离自高原牧区的5 株野毒菌株及1 株标准菌株的产毒能力进行了对比分析,在合适的培养基上,TB05 野毒菌株的产毒能力远远高于其他菌株的产毒能力,且产毒稳定性高,平均能达到4 万MLD/mL,远高于现用疫苗规程规定的4 000～10 000 MLD/mL 的产毒最低要求[6],用此菌株所产毒素制成的羊黑疫疫苗其对家兔及绵羊的免疫保护力同样优于对照组的现用疫苗的保护力。证明该野毒菌株具有替代现用羊黑疫疫苗生产菌株的潜在趋势。

诺维氏梭菌虽同属于产气荚膜梭菌,但其培养及产毒特性与其他菌存在明显差异,本试验在确定了疫苗候选株之后,对培养条件以及培养基成分进行了摸索和改良。本试验通过对产毒过程的观察以及间断性取样检测及毒力测定,确定在培养后72 h 作为抗原的收获时间。其次,通过不同pH 值对产毒的影响试验测得,该菌株最适产毒pH 值在8.2～8.4,这与报道,pH 值6.5～7.5 是产气荚膜梭菌生长和毒素产生的最佳pH 值条件[7]有一定差异。

同时,通过不同碳源加入量对产毒的影响试验,测得在含1.0%葡萄糖的培养基上,产毒最高,这与文献报道的易消化的碳水化合物像葡萄糖或糊精,均可提高产气荚膜梭菌产毒量[8]的论述相一致。

由于该菌导致的疫病具有发病急、病程短、死亡率高等特点,药物治疗很难达到效果,因此疫苗预防是控制该病的主要手段[9]。20 世纪80 年代初,我国成功研制出产气荚膜梭菌病的单价苗和多联灭活疫苗,在预防由产气荚膜梭菌引起的疫病方面发挥了重要作用。如中国兽医药品监察所文希韶等,在浙江杭嘉地区发生的急性传染病采集病原菌,研制了绵羊(湖羊)黑疫快疫混合疫苗,3 批苗免疫羊除第3 批1 只羊未保护外,2 mL 免疫剂量可抵抗100 MLD 攻毒剂量,免疫效果良好[10]。本试验中,利用TB05 地方菌株制备的羊黑疫菌苗免疫21 d 后,0.1 mL 血清可中和大于400 MLD/mL 的毒素量,免疫效果更佳。因此,该地方菌株可作为生产羊黑疫疫苗的备用菌株。