关于复方制剂中有关物质分析方法开发的综述

祝合燕

天津红日药业股份有限公司 天津 301700

在日常使用的药品中经常会遇到某些药品名称中含有“复方”二字，这类“复方类药物”顾名思义是由几种不同类别的药物组成的复方制剂，而其命名多为药品中的主要成分。如复方甘草酸苷片中含甘草酸苷、甘草酸单铵盐、甘氨酸、蛋氨酸四种成分，四者均有保肝的治疗作用，但以甘草酸苷为主，故而得名。与单方药物相比，将药物制成复方制剂可增加药物疗效，如复方磺胺甲噁唑由磺胺甲噁唑和甲氧苄啶组成，两药联合具有协同作用，增强了抗菌活性。某些药物制成复方制剂则是为了减少不良反应，如卡左双多巴控释片，其中的卡比多巴可减少多巴胺在外周组织的生成，从而减少心动过速、心律不齐等外周不良反应。此外，某些药物制成复方制剂则是为了减少患者服药次数，增加患者依从性，如缬沙坦氨氯地平片等药物。

1 前期调研

开发一个复方类药物的有关物质分析方法，首先要分析该制剂的处方组成及原研制剂的处方组成、使用说明书、包材及贮藏条件等。了解辅料与原料药的理化性质及结构式。查阅文献和国内外药典尤其是最新修改的EP或USP标准，对有关物质方法开发做足工作准备；其次是原料药的工艺信息，了解合成原料药的工艺路线和相应的起始物料及中间体，对杂质研究提供依据。那些是工艺杂质，那些是降解杂质做到分类清晰。为后续的专属性试验提供降解途径[1]。再者对原研品的杂质进行细致的剖析，在复方制剂中对于工艺杂质不必太过重视，由于原研品与仿制制剂存在工艺存在差异性。重点了解原研品的降解杂质，尤其是降解杂质的限度将对仿制制剂的降解杂质限度的制定具有指导意义，最后是针对仿制制剂的剂型特点选择合适的处理方式，摸索能够最大程度的体现有关物质的真实情况的样品处理方式。

2 筛选色谱柱

在色谱柱筛选阶段，本着简单有效的原则，首先选用相关质量标准中的液相条件进行色谱柱的筛选，若是复方制剂无相关参考标准，首先选用水和乙腈作为流动相，进行色谱柱的筛选，若是化合物对此体系不适用，那么就需要选择一个合适流动相，加入缓冲盐或者调整pH。最好走个全梯度，目标是保留时间位于整个色谱方法的时间的三分之一左右，即在此色谱柱上有保留；第二个目标是峰形良好，拖尾因子在合适的范围（0.95-1.05）之内，峰高且锐，峰宽在合适的范围（1min以内）之内，峰的理论塔板数达到2000以上，杂质能够被全部洗脱。

色谱柱类型的选择要根据化合物的性质进行选择，反向色谱柱的类型主要有C4，C8，C18，苯基柱，氰基柱，氨基柱，针对不同种类的化合物选择不同色谱柱的类型。由于苯环的Π电子作用，苯基柱对芳香族的化合物有很强保留，所以针对芳香族化合物物在其他类型色谱柱上没有保留的情况，可以首选苯基柱。C4，C8的色谱柱可以对极性小的化合物降低保留性，在短的时间内洗脱出来。氰基柱和氨基柱正反两相均可以用，主要分离一些极性强的化合物[2]。

C18色谱柱即十八烷基硅胶键合色谱柱（ODS），应用范围用于分离非极性，中等极性，弱极性的化合物。若是对化合物理化性质不了解，可以用C18的色谱柱进行摸索条件。由于C18色谱柱，在硅胶质量和键合工艺的不同，会导致对化合物的分离有所区别，所以在选择色谱柱时，应根据所分离化合物的性质（例如极性，酸碱性）进行选择。

硅胶质量分为普通硅胶和高纯硅胶两类，普通硅胶由于带有负电荷的残留硅羟基和酸性表面金属含量高，所以会导致碱性化合物的拖尾；高纯硅胶金属含量低，硅羟基的Pka高，碱性化合物不容易拖尾。

键合工艺的不同对分离不同性质化合物有着很重要的影响，如同样为ZORBAX系列的色谱柱，SDB-AQ系列可以耐100%水，而Eclipse则不能，原因是SDB-AQ键合工艺是二异丙基键合固定相，有着很大的空间位阻，可以防止键合固定相水解，因此pH可以低于2以下使用且可以耐收较高柱温，适用高极性化合物的分离。

键合工艺中，封端也起到了必不可少的作用，硅胶表面的硅羟基很多，除去键合固定相以外，很多剩余的硅羟基裸露在表面，很容易和碱性化合物发生作用，表现在色谱峰上就是拖尾严重，而ZORBAX Eclipse系列的色谱柱采用双封端技术，有效的减少了残留的硅羟基，适用于碱性化合物的分离，尤其是酸碱混合物的分离。

此外对于某些强极性的HILIC色谱柱也是不错的选择。

3 确定波长

复方制剂波长的确定应首先对各杂质及主药进行全波长扫描确定各成分的最大吸收波长，依据尽可能兼顾所有杂质最大吸收的原则，尽量选择比较平坦的波长。防止因波长改变杂质含量测定差异变大。对于兼顾不到的杂质，校正因子应在0.2-5.0之间；若是超过范围，用外标法计算杂质含量；此外波长的选择应统一考虑灵敏度和缓冲盐的截止波长，避免基线的噪音影响检测能力[3]。

4 确定流动相体系

色谱柱及波长确定后，对流动相进行筛选，可以用包含复方制剂所有杂质的混合溶液及破坏试验中产生杂质最多的样品进行摸索，目标为所有的杂质在该色谱柱和流动相体系下有合适的保留、峰形和分离度。

4.1 梯度条件的选择

梯度优化主要是通过调节流动相的起始比例和梯度的斜率来调整样品的保留时间、优化样品的分离度。梯度中有机相起始比例的变化可能对有关物质的分离有影响。在复方制剂方法开发中要考虑多个主药成分的杂质分离情况，在有些试验中有机相起始比例越小，样品保留时间越长，随着梯度的改变，样品出峰的先后顺序也有可能改变。我们做梯度优化时主要调整梯度的起始比例和斜率。现在的色谱柱或者采用了新的封端工艺，或者内嵌极性基团，耐水的能力都比较高。在酸性条件下很多化合物都以离子形式存在，极性较大，为了提高样品的分离度，尽量使用大比例的水做梯度的起始。对于添加缓冲盐的流动相要注意梯度变化过程中流动相组成改变时是否有盐析出。对于水加0.1%磷酸的流动相，开始时可以采用95%的水做起始比例，然后以95%的有机相结束，注意根据实际情况在梯度最后用大比例的有机相冲洗几分钟，以保证把小极性的杂质洗脱下来，防止样品残留到下一针。另外梯度的斜率一般采用凹线型的先小后大，梯度变化先慢后快，在此基础上再对梯度进行优化。使用缓冲盐溶液的梯度水相起始比例一般要从10-20%开始，为了防止盐析出，在梯度最后避免用纯的有机相做冲洗，梯度斜率采用恒定的就可以，在此基础上根据方法运行的情况对梯度进行调整。一般一个有关物质的样品采集的时间控制在40-50分钟左右，样品出峰在15-20分钟左右比较好，如果有极性非常小的杂质存在可以在最后加一段时间的大比例有机溶剂冲洗色谱柱，最后再设置10到15分钟左右的重新平衡时间以保证下一针的起始基线不受影响。具体平衡时间要根据试验结果进行确定。

4.2 水相pH的选择，选择水相的pH应根据化合物的PKa

优化峰间距和分离度时，希望样品保留时间随pH发生变化。这时选择pH在PKa±1范围内改变。其它情况，对于pH的微小变化，我们可能需要保持不变化的分离效果；这就要求pH小于PKa-2或者大于PKa+2，目的为了让化合物以一种状态存在，离子或者分子，避免色谱峰流出时分叉。

4.3 缓冲盐体系和非缓冲盐体系的确定

容易离子化的样品，需要加入缓冲盐来调节其分子和离子状态的比例，避免流动相流经色谱柱时，一部分随着流动相先流出，另一部分亲和于流动相后流出，导致色谱峰分叉。缓冲盐浓度：一般为10mmol/L，若是浓度过大会导致在梯度变化中有盐析出，对仪器有损坏。缓冲盐的浓度需要根据样品的溶解性及对有关物质分离度的影响进行确定。此外需要考虑到缓冲盐的截止波长，所采用波长越接近于缓冲盐的截止波长，那么基线噪音会越大，在有关物质方法开发中，影响药物检测的灵敏度。

5 确定供试品浓度

根据复方制剂中各杂质及主成分定量限的浓度，确定供试品的浓度。供试品的浓度一般为定量限浓度的2000至5000倍。保证0.1%水平浓度的样品的信噪比需要达到定量限的信噪比。专属性考察：在保证灵敏度合格的前提下，考察该浓度条件下，主峰与相邻杂质峰的分离度，专属性试验重点对各杂质进行归属，需要对空白辅料、单方的制剂与复方的制剂进行等条件破坏，以明确破坏产生的杂质属于哪个主成分的降解杂质。此时可以采用破坏产生杂质最多的供试品调节进样量来进一步验证灵敏度是否达到要求。

综上所述，通过前期资料调研、筛选色谱柱、确定检测波长、确定流动相体系及供试品浓度的确定五个方面对复方制剂中有关物质的开发进行了阐述，对有关物质方法开发尤其是复方制剂中有关物质方法的提供了清晰的思路。