九叶青花椒根结线虫病的病原鉴定

曹业凡 汪来发 王曦茁

摘要 为确定四川省蓬溪县九叶青花椒种植区发病植株花椒根结线虫的种类，进而为九叶青花椒根结线虫病防治提供依据，本文根据根结线虫雌虫与2龄幼虫的形态特征及雌成虫的会阴花纹、雌虫酯酶同工酶图谱，并结合特异性扩增及rDNA-ITS扩增，根据ITS序列构建系统发育树，对该地区九叶青花椒根结线虫病的病原进行了种类鉴定。结果表明该病原为南方根结线虫Meloidogyne incognita （Kofold & White） Chitwood。这是我国首次在九叶青花椒上发现南方根结线虫。

关键词 九叶青花椒; 南方根结线虫; rDNA-ITS

中图分类号： S 435.73， S 432.45  文献标识码： A  DOI： 10.16688/j.zwbh.2018402

Abstract In order to confirm the species of root-knot nematode on Zanthoxylum armatum var. novemfolius in Pengxi County， Sichuan province and provide the reference for prevention and controlling with root-knot disease， the nematode was identified by morphological observation， biochemical observation， specific amplification and rDNA-ITS sequence analysis. The results showed that the root-knot nematode on Z.armatum var. novemfolius was Meloidogyne incognita （Kofold & White） Chitwood. This is the first report of M.incognita on Z.armatum var. novemfolius in China.

Key words Zanthoxylum armatum var. novemfolius; Meloidogyne incognita; rDNA-ITS

九葉青花椒Zanthoxylum armatum DC.var. novemfolius Hong Ping Deng隶属芸香科Rutaceae花椒属Zanthoxylum，为竹叶花椒Z.armatum一变种。九叶青花椒起源于重庆江津区，目前在重庆、四川及贵州等省市有广泛栽培[1]。九叶青花椒与其他花椒种类Zanthoxylum spp.相比，具有花序多、花期较早，果实产量大、品质好等优势[2]，因此成为当地主要经济作物，并逐渐成为四川、重庆等省区退耕还林的首选树种[3]。随着九叶青花椒种植的集约化与树龄的增长，各大九叶青花椒产区的花椒病虫害开始暴发，如锈病、黑胫病、流胶病、煤污病等[4-5]。近几年来，在四川省遂宁市蓬溪县及周边地区，发现九叶青花椒感染根结线虫，致使九叶青花椒生长不良，产量下降，感病严重的地块，20%～30%的九叶青花椒树死亡。为鉴定四川蓬溪县九叶青花椒根结线虫病害病原，2016年5月至8月间，对蓬溪县宝梵镇和新星乡等乡镇的九叶青花椒产地进行病害调查，并采集发病严重的九叶青花椒上的根结线虫样品带回室内进行纯化培养，结合形态学特征、生物化学特征与分子生物学特征进行分析和鉴定，以期为九叶青花椒根结线虫病害的综合防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样本采集与病害调查

在四川省宝梵镇和新星乡九叶青花椒种植区采集感病花椒样品，使用随机取样法，对感病植株根部及其周围的病土进行采取，取样深度为表层土10～30 cm，各样地随机设置5个采样点，完成采样后将样品混匀放入同一个采集袋内并标记样品。将采集的标样带回实验室，在显微镜下挑取单卵块。将易感病品种‘918粉红种植于灭菌培养土中，待长出两片真叶时，将卵块接种于培养土中，培养60 d后进行病原鉴定[6]。

1.2 花椒根结线虫的获得

雌虫的分离与收集：经单卵块接种后的番茄苗培养60 d后，取感染线虫的番茄根用清水洗净，在体视显微镜下用镊子或解剖针针尖将根结表皮轻轻挑开，剖面出现的乳白色的光滑梨形物即为根结线虫的雌虫，用解剖针轻轻拨出，放入水中待用。

2龄幼虫的收集：室内单卵块繁殖60 d后，将番茄病根带回室内清洗并剪成1～3 cm的小段，将根段装入500 mL三角瓶中后倒入300 mL的1%次氯酸钠溶液，封口后猛摇3 min，立即用蒸馏水冲洗数次，先后过200目和500目筛，用蒸馏水反复冲洗留在500目筛子上的卵，最后用无菌水冲洗收集于无菌的小烧杯中。将上述卵放于26℃无菌培养箱中孵化3 d，得到根结线虫的2龄幼虫[5]。

1.3 形态学鉴定

观察头部特征、口针特征等。测量20条线虫体长、最大体宽、口针长和DEGO（背食道腺开口至口针基部球的距离）等形态指标。

雌成虫会阴花纹的制作与观察：参照王曦茁等[7]的方法，在体视显微镜下解剖根结线虫的成熟雌虫，将雌虫移入硬塑料板上的一滴体积分数45%乳酸中，用解剖刀切取尾端（虫体后部约1/4处），将尾端的体内组织去掉，切除尾端表皮多余的部分，仅留下会阴花纹部分。将会阴花纹转移至一块载玻片上的纯甘油滴中，一个玻片上放10块会阴花纹，以AFG液为浮载剂，用树脂封片，制成永久玻片。在显微镜下观察会阴花纹的形态特征并拍照。

1.4 同工酶鉴定

参照文献[8-9]，通过垂直板聚丙烯凝胶电泳做酯酶分析。首先配制浸提液（20%蔗糖+2%TritonX-100）、1 mol/L Tris-HCl pH 8.9缓冲液、1 mol/L Tris-HCl pH 8.3缓冲液、1 mol/L Tris-HCl pH 6.8缓冲液、1%过硫酸铵溶液、0.2%溴酚蓝。用移液器吸取5 μL浸提液至离心管中，将成熟雌虫转入管内，用研磨锥充分研磨，补加10 μL浸提液浸提酯酶同工酶。聚丙烯酰胺浓度分别为3%和7%。板大小为150 mm×120 mm，凝胶厚度1.5 mm，电极缓冲液为1 mol/L pH 8.3 Tris-HCl缓冲液。每孔加样量为20 μL（含浓度为1 mg/mL溴酚蓝溶液），电泳前30 min电压设为80 V，之后在190 V下电泳2 h，直到溴酚蓝指示条带迁移距离达到10 cm。电泳结束后进行染色，显色完全后用蒸馏水漂洗3次，之后在固定液（10%醋酸+10%甘油）中固定3 h以上，酯酶表型的命名参照文献[9]，以室内培育已鉴定的南方根结线虫Meloidogyne incognita样本作为参照系判读酯酶谱型，初步确定根结线虫的种类。

1.5 分子生物学鉴定

1.5.1 DNA提取

根结线虫的DNA提取方法参照磁珠法基因组提取试剂盒（天根）说明书并稍作优化。对花椒病根进行解剖，挑取根结线虫成熟雌虫，将根结线虫雌虫置于离心管并与研磨锥一同放入液氮中预冷后，用研磨锥研磨样品，加入20 μL蛋白酶K，经水浴裂解30 min后，加入350 μL异丙醇，振荡混匀后加入30 μL磁珠悬浮液，振荡混匀后静置3 min，反复3次;将离心管置于磁力架上，静置。待磁珠完全吸附后，吸弃液体;加入700 μL缓冲液，振荡混匀，吸弃液体;加入700 μL漂洗液，振荡混匀后置于磁力架上静置，吸弃液体后，将离心管置于室温晾干;将离心管取下并加入200 μL洗脱缓冲液并振荡混匀，56℃水浴10 min。之后将离心管置于磁力架上静置2 min，待磁珠完全吸附后，吸取DNA溶液并置于新离心管内，之后将DNA产物保存至-20℃备用。

1.5.2 PCR扩增

采用根结线虫ITS扩增通用引物[10]以及南方根结线虫特异性引物[11]进行PCR扩增。ITS片段扩增引物名称分别为F195：5′-TCC TCC GCT AAA TGA TAT G-3′和V5367：5′-TTG ATT ACG TCC CTG CCC TTT-3′，特异性扩增引物名称分别为：MiSF：5′-GGG CAA GTA AGG ATG CTC TG-3′和MiSD：5′-GCA CCT CTT TCA TAG CCA CG-3′。PCR扩增采用25 μL反应体系：12.5 μL 2×FastLong Taq PCR MsaterMix， 1 μL上游引物（10 μmol/L），1 μL下游引物 （10 μmol/L），1 μL DNA，9.5 μL ddH2O。PCR反应条件为：95℃预变性3 min;94℃变性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸20 s，反应共35个循环;最后72℃延伸10 min。4℃保存备用。PCR产物采用1.5%的琼脂糖凝胶110 V电泳30 min进行检测，用1×TAE作為电泳缓冲液，并在紫外灯下观测照相。

1.5.3 产物克隆与测序

将纯化后的ITS-PCR产物克隆至质粒载体pMD18-T（TaKaRa）上，选取每种群各5个阳性克隆由擎科公司测序。利用NCBI中的BLAST工具和DNAMAN 9.0软件，将获得的rDNA-ITS区序列与GenBank已登录的根结线虫序列进行比对分析。利用MEGA 6.0软件通过邻接法（neighbor-joining）构建系统发育树，采用Maximum Composite Likelihood模型。同时对构建的系统树作自展检验（bootstrap test）以获得分支的支持率，自展检验中重复抽样次数为1 000次，以秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans （X03680）的ITS序列作为外群。

2 结果与分析

2.1 九叶青花椒根结线虫病症状

九叶青花椒感染根结线虫后，植株矮小，叶片发黄、失绿，生长缓慢，感病严重的地块，20%～30%的九叶青花椒树死亡。九叶青花椒感病后其主根及根尖处开始膨大，并慢慢形成白色米粒状根结，随后侧根根部也出现膨大现象，并形成不规则白色米粒状根结，随着病情加重，根结逐渐膨大，颜色由白色变为黄色，当根部腐烂坏死时根结变成黑色，其根结主要分布在10～30 cm土层。剖开米粒状根结可见白色梨形雌虫，说明九叶青花椒树已感染根结线虫。

2.2 根结线虫形态学鉴定结果

雌虫：体白色，梨形，颈短，头区有不完整的环纹，口针纤细，口针基球呈扁圆形，同杆部的界线明显;口针锥部向背部明显弯曲，杆部末端较宽。

2龄幼虫：虫体呈线形，蠕虫状;头冠前端平宽，头部无突出与缢缩，有不完整环纹;口针纤细，锥部与杆部中等宽，基部缢缩且向后倾斜;尾有透明区。

会阴花纹：背弓高，呈方形，由平滑到波浪形的线纹组成。线纹在侧面分叉，侧线不明显，线纹弯向阴门，尾端区无刻点（图1）。

雌虫与2龄幼虫部分体长测量值如表1，参考文献[12-14]，初步确定九叶青花椒根结线虫为南方根结线虫M.incognita。

2.3 酯酶同工酶酶谱

将分离纯化的根结线虫种群进行同工酶分析，电泳结果如图2，该种群根结线虫雌成虫的酯酶同工酶谱均出现一条酯酶带，酯酶谱带类型为I1，相对迁移率为0.47，与南方根结线虫相同，因此确定该根结线虫为南方根结线虫。

2.4 分子生物学特征

根据琼脂糖凝胶电泳检测ITS-PCR产物与特异性引物扩增产物的结果，表明九叶青花椒根结线虫样本的rDNA-ITS片段大小为700 bp左右（图3），特异性扩增产物大小为500 bp左右（图4），其ITS片段以及特异性扩增片段同南方根结线虫的产物片段长度基本一致。将ITS-PCR产物所挑取的阳性克隆送至公司测序，通过DNAMAN 9.0拼接得到695 bp的ITS序列。将该序列上传至GenBank上进行BLAST，结果表明，获得的扩增产物ITS区域序列与已知南方根结线虫ITS区域序列的相似性达到99%。用MEGA 6.0软件构建系统发育树（图5）。从系统发育树来看，5个九叶青花椒根结线虫的ITS序列与南方根结线虫的遗传距离最近，支持率为97%，而与其他根结线虫的遗传距离相对较远。结合其ITS系统发育树以及特异性扩增产物，参照文献[10-11]并进行条带比较，说明在四川省发生的九叶青花椒根结线虫病的病原为南方根结线虫。

3 结论与讨论

磁珠法提取DNA适用于微量材料DNA提取，提取的DNA纯度高，浓度高，不含抑制剂，提取过程中无需过柱与离心，可有效避免提取微量材料的DNA时出现DNA损失，目前主要用于植物与动物DNA提取，广泛应用于法医学、分子生物学等领域[15-16]。目前国内尚未报道磁珠法用于提取线虫DNA，常规根结线虫的DNA提取方法主要通过裂解冻融法[17]，本文首次利用磁珠法成功提取根结线虫DNA。通过对根结线虫rDNA-ITS区域序列进行PCR扩增、克隆测序与比对，可有效鉴定根结线虫种类[18-20]。从九叶青花椒根部分离的线虫经rDNA-ITS片段比对以及特异性条带扩增鉴定为南方根结线虫M.incognita。本研究通过对九叶青花椒根结线虫进行雌虫和2龄幼虫的形态学鉴定和成熟雌虫的会阴花纹鉴定，以及雌虫酯酶同工酶分析和rDNA-ITS序列系统发育树的构建，结合特异性扩增条带，结果表明侵染九叶青花椒的根结线虫为南方根结线虫M.incognita。本试验在鉴定病原过程中，通过综合形态学、分子生物学、生物化学等鉴定方法，有效避免因鉴定方法单一而产生误差，做到准确、有效的分类[21]。这是我国首次报道由南方根结线虫M.incognita引起九叶青花椒根结线虫病害。

九叶青花椒属于多年生树种，3～4年进入盛产期，挂果期可延续至15年以上，生长寿命长达20～30年，故与常规农作物的根结线虫病害防治工作相比，根结线虫病害的防治工作具有长期性与持续性的特点，因此需结合不同地理条件与九叶青花椒生长期采取相应措施。

在进行育苗工作时，最好在无病区育苗，如若在发病区，可在育苗时进行育苗土预处理，可用石灰粉与表层土、腐熟有机肥进行搅拌混均，通过曝晒减少初侵染源。移栽幼苗时，注意检查根部有无根结，选择无病苗造林，同时在选择造林地时最好不要选择有根结线虫的地块。一旦发现病株，立刻就地销毁，防止病情扩散。如若有根结线虫，可对种植穴施用噻唑膦等杀线虫剂进行土壤消毒。对已感染根结线虫病的九叶青花椒林地，可通过使用生防真菌与生防细菌进行生物防治，减少土壤中根结线虫数量[22-24]，并施用土壤修复剂，如碳酸氧氨与生石灰等碱性肥料，改善土壤条件，增加根际土壤有益微生物的数量以及植物根系的活力，从而达到有效防治根结线虫病的目的。

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（责任编辑： 杨明丽）