安徽省玉米穗腐病主要致病镰孢菌的分离与鉴定

魏琪 廖露露 陈莉

摘要 为明确安徽省玉米穗腐病主要致病镰孢菌的种类，采用单孢分离、形态学鉴定和分子生物学鉴定的方法，对2017年采集自安徽省6个玉米主产区——合肥市、蚌埠市、淮北市、阜阳市、亳州市和宿州市的玉米穗腐病病样进行了分离鉴定。在获得的455株镰孢菌中，擬轮枝镰孢菌、禾谷镰孢复合种、层出镰孢菌、尖孢镰孢菌和黄色镰孢菌的分离频率分别为59.13%、21.28%、13.68%、5.12%和0.79%。其中拟轮枝镰孢菌在各地的分布最广，属于安徽省的优势致病镰孢菌。

关键词 玉米; 穗腐病; 镰孢菌

中图分类号： S 435.131  文献标识码： A  DOI： 10.16688/j.zwbh.2018362

Abstract In order to clarify the major pathogenic Fusarium species of maize ear rot in Anhui province， the samples were collected from six main maize regions of Hefei， Bengbu， Huaibei， Fuyang， Bozhou and Suzhou in 2017， and the pathogen was isolated and identified by single spore isolation， morphological and molecular identification. Among the 455 isolates of Fusarium， the isolation frequencies of Fusarium verticillioides，F.graminearum species complex， F.proliferatum， F.oxysporum and F.culmorum were 59.13%， 21.28%， 13.68%， 5.12% and 0.79%， respectively. The results showed that F.verticillioides was the most widely distributed and was the main pathogenic Fusarium species in Anhui province.

Key words maize; ear rot; Fusarium spp.

玉米是我国重要的粮食作物，同时也是重要的工业原料和畜牧饲料，而玉米穗腐病一直是玉米生产上的重要病害。玉米穗腐病由多种病原菌侵染引起。有研究表明，在我国引起玉米穗腐病的主要致病菌为镰孢菌，其次还有青霉、曲霉、木霉等，其中拟轮枝镰孢Fusarium verticillioides和禾谷镰孢复合种F.graminearum species complex为广泛分布的优势致病种类[1]。由于地理位置、气候条件等的不同，各地引起玉米穗腐病的镰孢菌种类也有所不同。重庆地区玉米穗腐病优势致病镰孢菌为拟轮枝镰孢、禾谷镰孢复合种和层出镰孢[2]。甘肃省和辽宁省的优势致病镰孢菌为拟轮枝镰孢[3-4]。黄淮海夏玉米主产区玉米穗腐病优势病原菌为拟轮枝镰孢、禾谷镰孢复合种和木霉[5]。目前，尚未见有关安徽省玉米穗腐病主要致病镰孢菌的系统报道。因此本试验从安徽省主要玉米生产区采集病样，通过形态学和分子生物学方法对致病镰孢菌进行分离鉴定，为安徽省玉米穗腐病的综合防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

玉米穗腐病病样的采集：2017年从安徽省6个玉米主产区——合肥市、蚌埠市、淮北市、阜阳市、亳州市和宿州市共采集玉米穗腐病病样226份，所有病样均用纸袋包好带回实验室进行分离鉴定。

供试培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar， PDA）培养基;合成低营养琼脂（spezieller nhrstoffarmer agar， SNA）培养基;水琼脂（water agar， WA）培养基。

试剂：2×Taq Plus Master Mix、100 bp Plus DNA Ladder、5 U Taq DNA聚合酶、10×Buffer、2.5 mmol/L dNTPs，宝日医生物技术（北京）有限公司;镰孢属/种的特异性引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 玉米穗腐镰孢菌的单孢分离

从发病玉米穗上随机挑取30个籽粒，置于3% NaClO溶液中，浸泡消毒2 min，再放入75%乙醇中停留10 s，快速取出放入无菌水中清洗，置于灭菌滤纸上吸干水分。随机夹取玉米籽粒均匀放置在加有链霉素的PDA平板上，置于25℃培养箱中黑暗培养，待籽粒周围长出菌丝后，挑取菌丝置于新的PDA平板上进行纯化培养，4～7 d后观察形态。将疑似镰孢菌的菌株进行单孢分离，挑取部分菌丝置于1.0 mL无菌水中，通过连续稀释，配制成终浓度为1个/μL的孢子悬浮液，吸取30 μL于SNA平板上，均匀涂板，置于25℃下培养48 h，挑取单菌落于新的SNA平板上再培养4～5 d，即获得单孢纯培养菌株[6]。镰孢菌分离频率的计算公式如下：

各属真菌的分离频率=携带各属真菌的玉米籽粒数/总玉米籽粒数×100%;

各种镰孢菌分离频率=同种镰孢菌株数/镰孢菌总株数×100%。

1.2.2 玉米穗腐镰孢菌的鉴定

将单孢纯培养的菌株分别接种到加有抗生素的PDA和SNA平板上，4 d后测量菌落直径并计算生长速率，7 d后观察菌株在PDA培养基上的菌落形态、颜色变化以及在SNA培养基上的孢子形态、大小、着生方式等特点。参考Booth和Leslie等的镰孢菌形态学鉴定方法[7-8]，初步确定镰孢菌的种类。

[2] 周丹妮，王晓鸣，李丹丹，等.重庆及周边地区玉米穗腐病致病镰孢菌的分离与鉴定[J].植物保护学报，2016，43（5）：782-788.

[3] 郭聪聪，朱维芳，付萌，等.甘肃省玉米籽粒中镰孢菌分离频率及伏马毒素含量监测[J].植物保护学报，2015，42（6）：942-948.

[4] 肖淑芹，許佳宁，闫丽斌，等.辽宁省玉米镰孢穗腐病病原菌的鉴定与分布[J].植物保护学报，2017，44（5）：803-808.

[5] 孙华，张海剑，郭宁，等.黄淮海夏玉米主产区穗腐病病原菌的分离鉴定[J].植物保护学报，2017，44（5）：796-802.

[6] 张昊，张争，许景升，等.一种简单快速的赤霉病菌单孢分离方法—平板稀释划线分离法[J].植物保护，2008，34（6）：134-136.

[7] BOOTH C. The genus Fusarium [M]. Kew， Surrey， UK： Commol/Lon-wealth Mycological Institute， 1971.

[8] LESLIE J F， SUMMERELL B A. The Fusarium laboratory manual [M]. Ames （IA）： Blackwell Publishing， 2006.

[9] BLUHM B H， FLAHERTY J E， COUSIN M A， et al. Multiplex polymerase chain reaction assay for the differential detection of trichothecene-and fumonisin-producing species of Fusarium in cornmeal [J].Journal of Food Protection，2002，65（12）： 1955-1961.

[10] MUL G， SUSCA A， STEA G， et al. A species-specific PCR assay based on the calmodulin partial gene for identification of Fusarium verticillioides， F.proliferatum and F.subglutinans[J]. European Journal of Plant Pathology， 2004， 110（5/6）： 495-502.

[11] MISHRA P K， FOX R T V， CULHAM A. Development of a PCR-based assay for rapid and reliable identification of pathogenic Fusaria [J].FEMS Microbiology Letters，2003，218（2）： 329-332.

[12] NICHOLSON P， SIMPSON D R， WESTON G， et al. Detection and quantification of Fusarium culmorum and Fusarium graminearum in cereals using PCR assays [J]. Physiological and Molecular Plant Pathology， 1998， 53（1）： 17-37.

[13] SCHAAFSMA A W， LIMAY-RIOS V， TAMBURIC-ILLINCIC L. Mycotoxins and Fusarium species associated with maize ear rot in Ontario， Canada[J]. Cereal Research Communications， 2008， 36： 525-527.

[14] SAMPIETRO D A， DIAZ C G， GONZALEZ V， et al. Species diversity and toxigenic potential of Fusarium graminearum complex isolates from maize fields in northwest Argentina [J]. International Journal of Food Microbiology， 2011， 145（1）： 359-364.

[15] STUMPF R， DOS SANTOS J， GOMES L B， et al. Fusarium species and fumonisins associated with maize kernels produced in Rio Grande do Sul State for the 2008/09 and 2009/10 growing seasons [J]. Brazilian Journal of Microbiology， 2013， 44（1）： 89-95.

[16] 郭成，魏宏玉，郭满库，等.甘肃玉米穗腐病病样中轮枝镰孢菌的分离鉴定及生物学特性[J].植物病理学报，2014，44（1）： 17-25.

[17] BOTTALICO A. Fusarium diseases of cereals： species complex and related mycotoxin profiles， in Europe [J]. Journal of Plant Pathology， 1998， 80（2）： 85-103.

[18] LOGRIECO A， MUL G， MORETTI A， et al. Toxigenic Fusarium species and mycotoxins associated with maize ear rot in Europe [J].European Journal of Plant Pathology，2002，108（7）： 597-609.

[19] 任旭，朱振东，李洪杰，等.轮枝镰孢SSR标记开发及在玉米分离群体遗传多样性分析中的应用[J].中国农业科学，2012，45（1）：52-66.

（责任编辑： 杨明丽）