广西香蕉细菌性软腐病病原鉴定及生物学特性研究

杜婵娟 杨迪 付岗

摘要 为明确引起广西香蕉细菌性软腐病的病原，采用组织分离法从染病的香蕉组织中分离病原菌，通过柯赫氏法则验证其致病性。对病原菌进行形态学观察、分子鉴定、生理生化测试及生物学特性测定。结果表明，从染病蕉头和蕉果分离到的病原菌，其菌株的形态特征、生理生化测试结果与Dickeya sp.基本一致，16S rDNA基因序列与Dickeya 属细菌的同源性达99%;其最适培养温度为28℃，最适pH为7.0。病原菌的dnaX、gryB和recA基因序列与D. zeae的同源性均在97%以上。多基因系统发育树显示，病原菌与所有的D. zeae细菌聚在同一个最小进化分支里，自展支持率为100%。根据以上结果，将引起广西香蕉细菌性软腐病的病原菌鉴定为Dickeya zeae。同时，测定7种杀菌剂对GR-1菌株的室内毒力，46%氢氧化铜WG的EC50最低，为186.69 mg/L; 其500倍稀释液对GR-1菌株的抑菌效果最好，达76.89%。

关键词 香蕉; Dickeya zeae; 病原鉴定; 多基因系统发育; 生物学特性

中图分类号： S 436.681  文献标识码： A  DOI： 10.16688/j.zwbh.2018413

Abstract In order to clarify the pathogen causing banana bacterial soft rot in Guangxi， the pathogenic bacteria were isolated by tissue separation method from tissues of diseased banana， and their pathogenicity were verified through Kochs Rule. The pathogen was identified based on morphology， physiological and biochemical characteristics， molecular identification and biological characteristics. The results showed that the pathogenic bacteria were isolated from the pseudostem and fruit of diseased bananas. Their morphological characteristics， physiological and biochemical results were basically consistent with Dickeya sp.， and the 16S rDNA gene sequences shared 99% similarity with that of Dickeya sp.. The optimum temperature for the pathogenic bacterium was 28℃， and the optimum pH was 7.0. The homology of dnaX， gryB and recA gene sequences between the pathogenic bacterium and D. zeae was more than 97%. Multiple-gene phylogenetic analyses indicated that the pathogen and all the bacteria of D. zeae clustered in the same evolutionary branch， with a self-supporting rate of 100%. According to these results， the pathogen causing banana bacterial soft rot in Guangxi was identified as Dickeya zeae. Furthermore， the toxicity of 7 types of bactericides against strain GR-1 were tested. The EC50 of copper hydroxide 46% WG was the lowest among the tested bactericides （186.69 mg/L）， and its 500 times dilution had the best inhibition effect on GR-1 strain， up to 76.89%.

Key words banana; Dickeya zeae; pathogen identification; multiple-gene phylogeny; biological characteristics

香蕉是我國南亚热带地区的特色作物，也是广西重要的经济作物。2016年起，陆续在广西玉林、北海等市县的蕉园发现一种新型病害，可侵染‘金粉、‘广粉和‘威廉斯等香蕉主栽品种，主要危害香蕉球茎和生长点，导致假茎软腐发臭，叶片发黄，严重时整株倒伏和死亡。此外，该病害在田间亦可感染蕉果，导致果实由内而外变褐腐烂，造成蕉果发育缓慢，果指细小，往往其果皮颜色与健果无多大区别，但果肉内已发生明显褐变或腐烂。该病害在香蕉苗期至成株期均可发生，并呈逐渐上升的趋势，部分蕉园发病率达20%，病死率达70%。高温多雨、地表温度高和田间排水不畅造成园间积水等会加速该病害的发生和流行。国内外已报道的危害香蕉假茎的病害有：由尖孢镰刀菌古巴专化型Fusarium oxysporum f.sp. cubense引起的香蕉枯萎病、由青枯菌Ralstonia solanacearum引起的香蕉细菌性枯萎病、由菊欧文氏菌Erwinia chrysanthemi引起的香蕉细菌性软腐病、由黄瓜花叶病毒香蕉株系Cucumber mosaic virus banana strain引起的香蕉花叶心腐病、由香蕉束顶病毒Banana bunchy top virus （BBTV）引起的香蕉束顶病等;危害蕉果的病害有：由芭蕉炭疽菌Colletotrichum musae引起的香蕉炭疽病、由轮纹镰孢Fusarium concentricum引起的香蕉冠腐病、由香蕉大茎点霉Macrophoma musae引起的香蕉黑星病以及由可可轮枝孢Verticillium theobromae引起的香蕉烟头病等[1-5]。然而，目前对广西田间发生的既危害香蕉植株，同时又危害香蕉果实的这种新病害，在国内尚未见相关报道，也不明确其病原菌的分类地位。因此，对该病害的病原菌进行鉴定与分类，是有效防治该病害的基本前提。为明确该病害的病原，本研究通过对染病的香蕉假茎和蕉果进行组织分离，以柯赫氏法则验证病原的致病性，并对其进行形态学观察、分子生物学鉴定、生理生化测试及生物学特性测定，以期为该病害的有效防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 培养基和供试药剂

NA培养基： NaCl 5 g、牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、琼脂15 g、水1 000 mL， pH 7.0～7.2; 以不加琼脂为液体培养基。

供试杀菌剂：3%中生菌素可湿性粉剂（青岛农博士生物科技有限公司）、46%氢氧化铜水分散粒剂（美国杜邦公司）、80%代森锰锌可湿性粉剂（陶氏益农农业科学有限公司）、1.6%噻霉酮涂抹剂（陕西西大华特科技实业有限公司）、18%松脂酸铜乳油（河南世诚科技有限公司）、1.8%辛菌胺醋酸盐水剂（西安嘉科农化有限公司）、80%乙蒜素乳油（河南科邦化工有限公司）。

1.2 病原菌的分离与纯化

2016年8月，从广西玉林市兴业县香蕉种植区采集感病香蕉的蕉头和蕉果，于病健交界处切取1 cm2的组织小块，用75%乙醇浸泡30 s，0.1%升汞消毒1 min，然后用无菌水冲洗3次，再将其放至灭菌的研钵中，加入5 mL无菌水并充分研磨，用灭菌接种环蘸取研磨液在NA平板上划线，置28℃培养24 h，挑取优势单菌落进行纯化。

1.3 病原菌的致病性测定

将分离纯化得到的病原菌接种至NA液体培养基，于28℃，150 r/min培养24 h，得到浓度为1×108 cfu/mL的菌悬液，备用。蕉苗接种： 取4～5叶期的‘威廉斯B6香蕉健康植株，采用注射接种法，将500 μL菌悬液接种至蕉苗假茎下部，以无菌的NA液体培养基为空白对照，每处理5次重复。蕉果接种： 采用注射接种法进行活体接种，用针刺穿果皮后，将1 mL菌悬液接种至香蕉果肉，以无菌的NA液体培养基为空白对照，每处理5次重复。

以上试验在广西农业科学院植物保护研究所玻璃网室进行，试验期间日平均气温28℃，每天喷水保湿，观察并记录蕉苗及蕉果的发病情况。分别在接种后第4天观察蕉苗接种结果，在接种后第10天观察蕉果接种结果。

1.4 病原菌的鉴定

1.4.1 形态学观察

挑取病原菌至NA平板，28℃培养24 h，观察菌落形态; 同时对培养20 h的菌体进行透射电镜观察，观察菌体的大小及形态特征。

1.4.2 16S rDNA序列分析

采用生工生物工程（上海）股份有限公司的Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒对病原菌进行总DNA的提取，以通用引物27F/1492R（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′/5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）进行16S rDNA扩增。PCR反应体系为25 μL，包括10×PCR Buffer 2.5 μL，MgCl2（25 mmol/L）3 μL，dNTPs（10 mmol/L）1 μL，27F/1492R （10 μmol/L）各1 μL，Taq酶（5 U/μL） 0.5 μL，模板DNA 1 μL;ddH2O補足至25 μL。反应程序为：94℃预变性3 min;94℃变性45 s，57℃退火1 min，72℃延伸1 min，35个循环;最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳回收目标DNA片段后，委托上海鼎安生物科技有限公司进行测序，测序结果用BLAST软件在GenBank数据库中进行同源性比对，采用MEGA 4.0的Neighbor Joining法以相近序列构建系统发育树。

1.4.3 多基因分子鉴定

为进一步明确病原菌的分类小种，分别选择DNA聚合酶Ⅲ亚基基因（dnaX）、DNA促旋酶基因（gryB）和重组酶基因（recA）对病原菌的总DNA进行扩增与测序，引物序列信息见表1。反应体系参照1.4.2，反应程序为：94℃预变性5 min;94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环;最后72℃延伸5 min，4℃保存。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳回收目标DNA片段后，委托上海鼎安生物科技有限公司进行测序。

病原菌多基因系统发育树的构建：在GenBank数据库中下载同时含有dnaX、gryB和recA这3个基因序列的其他Dickeya sp.细菌的菌株序列，与测序获得的病原菌的3个基因，依次经过Clustal X 软件比对且校正后，分别按照dnaX-gryB-recA的顺序首尾相连，并进行同源性分析。以果胶杆菌Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum作为外群，采用MEGA 4.0的Neighbor Joining法构建病原菌株基于dnaX、gryB和recA基因序列的系统发育树。

1.4.4 生理生化测试

病原菌的生理生化鉴定，参照《植病研究方法》[6]和《伯杰细菌鉴定手册》[7]进行。

1.5 病原菌的生物学特性测定

为进一步了解病原菌的生物学特性，以更好地对该病害进行防治，分别从温度、pH及抗药性等方面进行研究。参照1.3的方法制备病原菌的菌悬液，用无菌水调整菌悬液的浓度为1×108 cfu/mL，4℃保存备用。

1.5.1 温度对病原菌生长的影响

取1 mL病原菌的菌悬液至100 mL NA液体培养基，分别置于10、13、16、19、22、25、28、31、34、37℃和40℃，150 r/min培养18 h，每处理3次重复。于600 nm波长下，用紫外分光光度计测定各处理菌液的吸光值（OD）。

1.5.2 pH对病原菌生长的影响

分别取1 mL病原菌的菌悬液，至100 mL NA液体培养基，培养基的pH分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5和11.0，150 r/min培养18 h，每处理3次重复; 于600 nm波长下，用紫外分光光度计测定各处理菌液的吸光值（OD）。

1.5.3 杀菌剂对病原菌的室内毒力测定

参照严婉荣等[8]的方法，略作修改。在灭菌培养皿上距中央2.5 cm处对称放置3个灭菌牛津杯。将病原菌的菌悬液按1%（V/V）的量加入熔化后冷却至45℃的NA培养基，振荡摇匀，迅速倒入放有牛津杯的平板，凝固后取出牛津杯，形成直径7 mm 的小孔。用无菌水对供试的7种药剂（表1）进行梯度稀释，配制成500、1 000、2 000、4 000、8 000倍的药液，使药剂的含量分别为2 000、1 000、500、250、125 mg/L。分别取50 μL不同濃度的药剂至各小孔，以无菌水为对照，每个浓度3次重复，28℃培养48 h，采用十字交叉法测量抑菌圈直径，计算相对抑菌率。以药剂浓度对数值为自变量（x），相对抑菌率的几率值为因变量（y），建立毒力回归方程，计算决定系数R2和抑菌有效中浓度EC50。

相对抑菌率=

处理抑菌圈直径-对照抑菌圈直径处理抑菌圈直径×100%。

1.6 数据统计与分析

所得数据用Excel 2016进行汇总、平均值计算和作图，差异显著性采用DPS 7.05软件的Duncan氏新复极差法进行分析。

2 结果与分析

2.1 田间病害症状

该病害的田间症状为：首先在球茎或球茎与假茎交界处产生褐色斑点，病斑随后向周边扩展，球茎很快腐烂发臭（图1a）; 假茎形成海绵状软腐，内部维管束变褐色（图1b）; 病株生长点坏死，生长迟缓，心叶萎缩或黄化，叶片逐渐变黄枯萎（图1c）。严重时整株枯死，极易推倒或被风吹倒。该病有时也可感染果实，导致个别果实由内而外变褐腐烂（图1d～e）。

2.2 致病性测定

采用稀释分离法分别从染病蕉头和蕉果中分离纯化得到细菌GR-1菌株和GR-2菌株。采用注射接种法，分别将2个菌株接种至健康香蕉苗的假茎。接种1 d后，接种点出现深褐色病斑并发生腐烂，随后病斑逐渐向上蔓延至新叶，引起生长点坏死，假茎开裂及叶柄腐烂，导致叶片黄化下垂。接种4 d后，发病严重的蕉苗整株软腐倒伏，叶片全部死亡。而将菌株接种至香蕉果肉中，接种10 d后，先在接种点出现红褐色病斑，随后病斑在果肉中逐渐扩大，呈深褐色，使果皮开裂，造成果肉腐烂。以上症状均与田间症状相符（图2）。

2.3 病原菌的形态特征

形态学观测结果表明，病原菌呈直杆状，大小（0.5～1.0） μm×（1.0～3.0） μm，革兰氏阴性，周生鞭毛运动，不形成芽胞（图3a）;其在NA平板上生长，菌落为乳白色，略带灰色，近圆形，中间凸起，并具有波状或珊瑚状的边缘（图3b）。

2.4 病原菌的16S rDNA序列分析

以通用引物27F/1492R对GR-1和GR-2菌株的基因组DNA进行PCR扩增，经电泳检测获得长度约1 500 bp的DNA片段（图4）。回收该片段进行测序，得到长度为1 370 bp的GR-1菌株基因序列（GenBank登录号：MF041857），以及长度为1 348 bp的GR-2菌株基因序列（GenBank登录号：MK578204）。在GenBank中进行BLAST比对显示，与GR-1和GR-2菌株序列同源性在99%以上的菌株均为Dickeya sp.。用软件MEGA 4.0将GR-1和GR-2菌株与GenBank中的11株临近种属的细菌一起构建基于16S rDNA序列的系统发育树，结果（图5）表明，病原菌GR-1和GR-2菌株聚在同一最小分支内，自展支持率为100%，表明它们的亲缘关系最接近。此外，病原菌GR-1和GR-2菌株与Dickeya sp.的细菌处于同一个大分支内，自展支持率为80%，表明它们与Dickeya sp.的细菌在进化上的距离最近。因此，初步将病原菌GR-1和GR-2菌株鉴定为Dickeya sp.。

2.5 病原菌的多基因分子鉴定

对GR-1菌株的dnaX、gryB和recA基因序列进行测序，测序后分别获得长度为509 bp的dnaX序列（GenBank登录号：MK566230）、长度为 2 301 bp的gryB序列（GenBank登录号：MK566228）和长度为713 bp的recA序列（GenBank登录号：MK566229）（图6）。在GenBank中进行BLAST比对，显示这3段序列与D. zeae的同源性均在97%以上。在GenBank中下载23株同时含有dnaX、gryB和recA基因的Dickeya sp.菌株序列，与Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum作为外群进行分析，结果（图7）表明，在dnaX-gryB-recA 3个保守基因构建的系统发育树中，23株Dickeya sp.菌株分别以较高的支持率聚在6个不同的分支里，每一个分支都代表了对应的Dickeya 小种。其中，GR-1菌株与所有的D. zeae细菌聚在同一个最小进化分支里，且自展支持率为100%。

2.6 病原菌的生理生化特征

选取菌株GR-1进行了生理生化特性的测试，结果表明：菌株可液化明胶，但不能水解淀粉;可分解蛋白胨生成吲哚，不能分解半胱氨酸产生H2S;硝酸盐还原反应和VP试验为阴性;不能利用苯丙氨酸; 可发酵葡萄糖产酸，但不产气;能利用木糖、甘露醇、甘露糖、棉子糖、果糖、蔗糖，但不能利用乳糖、麦芽糖和山梨醇（表2）。对照《伯杰细菌鉴定手册》[7]，该菌株生理生化的测定结果与Dickeya属细菌的特征基本相符。

因此，根据形态学特征、生理生化测试和分子生物学鉴定结果，将病原菌GR-1鉴定为Dickeya zeae。

2.7 温度对GR-1菌株生长的影响

由图8可知，菌株GR-1在10～40℃范围内均可生长。当温度为28℃时，菌株GR-1生长最好，其OD600为0.737; 当温度低于16℃时，该菌株生长最差，OD600低于0.156。

2.8 pH对GR-1菌株生长的影响

GR-1菌株在pH 4.5～8.5范围内生长较好，其OD600均在1.373以上，并在pH为7.0时达到最大值，OD600为2.315;而pH>9.0时，该菌株的OD600则迅速下滑至0.753以下。pH<4.0或pH>9.5时，均不适合GR-1菌株生长（图9）。

2.9 杀菌剂对病原菌的室内毒力测试

建立了7种杀菌剂对供试菌株的毒力回归方程，计算各杀菌剂的抑菌有效中浓度EC50。从表3可知，测试的7种药剂中，除18%松脂酸铜EC和80%乙蒜素EC完全没有抑菌效果以外，其他5种药剂均表现出一定的抑菌效果。各药剂的抑菌率都随着稀释浓度的升高而降低。其中，46%氢氧化铜WG的EC50最低，为186.69 mg/L，其抑菌效果较好，并在稀释为500倍时的抑菌率最高，为76.89%; 而1.6%噻霉酮PN的EC50最高，为2 031.84 mg/L，其抑菌效果一般;而1.8%辛菌胺醋酸盐在稀释倍数高于4 000倍时，则不表现抑制作用。

3 讨论

香蕉细菌性软腐病最早于1983年在西孟加拉地区发生[9]，而哥伦比亚[10]、韩国[11]、伊朗[12]及印度南部[13]等地也有相关报道。在我国，该病害最早在广东发生[3]。2016年在广西玉林市兴业县香蕉种植区发现细菌性软腐病，症状与Lin等[3]、番华彩等[14]的报道相似。CHIO等[11]在韩国大田市大棚发现Erwinia carotovora subsp. carotovora和Pseudomonas cichorii 可引起香蕉果实的软腐病。Lin等[3]将香蕉软腐病菌人工接种至香蕉果实上，可引起果实腐烂。与前人报道不同的是，本研究在国内首次发现病菌可在田间自然侵染香蕉果实，导致个别蕉果由内而外变褐腐烂。结合形态学观察、分子生物学鉴定、生理生化测试及生物学特性测定的结果，本研究将发生在广西的香蕉软腐病菌鉴定为Dickeya zeae。

值得注意的是，本研究将从蕉头和蕉果分离到的病原菌再分别回接至健康蕉头和蕉果，病菌均可导致两个不同部位发病。表明染病蕉果能够传播该病害。由于收获后蕉果在各地的调运销售相当频繁，极易造成该病的远距离跨区域传播。这在病害防控中应当引起足够重视。

Dickeya sp.原名Pectobacterium chrysanthemi、Erwinia chrysanthemi[15]，可引起多种作物的软腐病，共包含6个致病种，分别为D. dadantii、D. dieffenbachiae、D. dianthicola、D. paradisiaca、D. chrysanthemi和D. zeae [19-21]。由于Dickeya sp.每个种之间的基因差异很小，种群分类复杂，且与同科的果胶杆菌属Pectobacterium sp. 在分子生物学上也非常接近。因此，仅从形态学、生理生化测试和16S rDNA基因序列信息进行区分获得的鉴定结果并不可靠，需要通过多个保守基因序列进行鉴定，以提高病原菌的识别率。Hu等[22]通过atpD-gyrB-infB-rpoB 4个基因进行联合分析，将亲缘关系非常相近的Dickeya sp.不同种的菌株划分成不同的系统发育谱系，用于Dickeya sp.菌株种间的鉴定。Lin等[3]采用dnaX-gryB-recA多基因系统发育分析方法，将形态上与Dickeya属细菌极难区分的香蕉软腐病病原菌鉴定为D. zeae。本研究通过dnaX、gryB和recA 3个基因序列，构建了包含24株Dickeya sp.菌株的多基因系统发育树，结果表明，病原菌GR-1菌株与6株D. zeae序列聚在同一个进化分支，系统进化分析显示置信度达100%;而其他同种的Dickeya sp.菌株也以非常高的相似度聚在同一进化分支。因此将病原菌GR-1菌株鉴定为D. zeae。

测定了7种杀菌剂对GR-1菌株的抑菌效果，结果表明，46%氢氧化铜WG、80%代森锰锌WP、3%中生菌素WP、1.6%噻霉酮PN、1.8%辛菌胺醋酸盐AS对香蕉细菌性軟腐病菌均有一定的抑菌作用。Wey等[23]报道了代森锰锌对香蕉细菌性软腐病菌具有较好的抑制效果，与本研究结果相似。

香蕉细菌性软腐病是广西近年来发生较为严重的新型细菌性病害，其扩散速度快，危害性大，对广西香蕉的生产已构成严重威胁，使香蕉种植业面临严峻形势。目前已有相关报道证明，香蕉细菌性软腐病病原菌可侵染天南星科、景天科、仙人掌科、大戟科、百合科、苦苣苔科、石竹科、禾本科、茄科、菊科、鸢尾科、芭蕉科、十字花科、伞形科等14 科21 种植物[24]。因此，对香蕉细菌性软腐病的防治，除加强检验检疫外，还应积极开展抗病品种选育，加强田间水肥管理，并注意与非寄主作物轮作，以控制该病在广西香蕉种植区蔓延。

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（责任编辑： 田 喆）