肾移植术后急性肾损伤患者血清氨基酸水平变化及相关性分析

李志琪，王清华

(1.陆军军医大学第二附属医院药学部，重庆 400037;2.泸州市中医医院药剂科，四川泸州 646000)

氨基酸是人体生命活动中至关重要的一类代谢物质基础，具有广泛的生物学功能。肾脏是新陈代谢最为旺盛的器官之一，也是氨基酸代谢的重要组织器官，对体内氨基酸代谢有着重要影响。病理条件下，肾脏代谢功能失调均会引起氨基酸代谢发生紊乱，导致血液中氨基酸水平变化，如不同阶段慢性肾脏疾病[1-5]、血液透析[1,6]、肾移植排斥[7]、急性肾损伤[8-10]等。因此，检测肾移植术后急性肾损伤患者血清需氨基酸水平有着重要的意义。本研究旨在探讨肾移植术后和肾移植术后AKI患者精氨酸(Arg)、对称二甲基精氨酸(SDMA)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和犬尿氨酸(Kyn)等血清氨基酸的水平及变化情况，以及氨基酸与肾小球滤过率(eGFR)、尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)、尿酸(UA)、他克莫司血药水平(FK506 Cmin)和口服他克莫司量与他克莫司血药水平比值(Oral FK506/FK506 Cmin)等肾功能指标的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料 研究对象为2016年12月至2017年11月在陆军军医大学第二附属医院住院的肾移植患者，其中男36例，女29例，平均年龄(37.40±10.71)岁。另选择健康志愿者79例为对照(CHV组)，其中男7例，女7例，平均年龄(31.29±7.83)岁。所有肾移植患者和健康志愿者均进行详细的检查，包括所有的临床生化检测指标、体征、血常规、血型、粪常规、尿常规、仪器检查心电图、腹部彩超、胸腹部CT检查、病史资料、药物不良反应等。依据改善全球肾脏病预后组织(KDIGO)定义急性肾损伤诊断标准将肾移植患者分为肾移植术后使用FK506表现正常者(ART组)37例，肾移植术后使用FK506发生急性肾损伤者(AKI组)28例。

肾移植患者口服免疫抑制的方案为：FK506、强的松片、赛可平片或米芙的三联免疫用药。纳入标准：有SCr、BUN、UA和FK506血药水平监测数据等的患者，心、肺、肝等功能正常者；医嘱良好患者，无糖尿病等并发症的患者；无感染患者(HIV抗体阴性、梅毒试验阴性)；肾功能愈合表现为正常的患者。排除标准：有使用过其他免疫抑制剂如环孢素的患者；肝移植、其他器官移植和多器官移植者；有癌症者；资料不完整，年龄<18或>60岁者；妊娠妇女；甲状腺功能亢进或减退者；抗真菌药物及其他引起的肾毒性患者；肾移植感染的患者；肾移植肾炎患者；研究中出现排斥的患者；个人原因放弃者(死亡者)。所有研究对象于上午8：00-9：00点抽取空腹静脉血5 mL置于乙二胺四乙酸三钾采血管内，震荡摇匀，静止30 min后取上层血清置于1.5 mL EP管中，保存于-20 ℃冰箱待测。

1.2血清氨基酸测定 血清氨基酸水平采用前期建立的超高效液相色谱-质谱联用(UHPLC-MS/MS)法[8]进行检测。取血清样本100 μL，置于1.5 mL EP管内，加入300 μL蛋白沉淀剂乙腈(含0.2%甲酸和0.4 μg/mL内标物)，静止3 min，涡旋2 min，13 400×g高速离心15 min，取上层清液，转至进样小瓶进行分析。

色谱条件：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱(3 mm×150 mm，5 μm)，流动相系统。A相为甲醇；B相为水相(包含0.20%甲酸和0.02%七氟丁酸)，柱温为50 ℃，进样量2 μL，采用ESI源正离子多反应监测模式(MRM)进行质谱分析。质谱参数优化后如下：雾化气压力345 kPa；干燥气温度325 ℃；流速10 L/min；鞘气温度350 ℃，毛细管电压5 kV。

2 结 果

2.1肾功能临床生化指标结果 与CHV组、ART组比较，AKI组患者eGFR值明显下降，SCr、BUN、UA及Oral FK506/FK506 Cmin值明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2血清氨基酸水平结果 与CHV组、ART组比较，AKI组患者血清Arg、SDMA、Phe和Kyn水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)；血清Trp水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)；血清Tyr水平无明显降低，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1 肾功能临床生化指标分析结果

注：*表示t检验，+表示Mann-WhitneyU检验；分别与CHV组和ART组两两比较，*和+表示P<0.05，**和++表示P<0.01

2.3肾损伤患者血清氨基酸水平与临床生化指标相关性分析 对28例肾移植术后使用FK506发生急性肾损伤患者的血清Arg、SDMA、Phe、Trp、Tyr和Kyn水平与反映肾功能的常规临床生化指标(eGFR、BUN、SCr、UA、FK506 Cmin和Oral FK506/FK506 Cmin)进行相关性分析,结果表明,SDMA与eGFR、FK506 Cmin、Oral FK506/FK506 Cmin呈负相关(P=0.005、0.026、0.001)，与BUN、SCr呈正相关(P=0.002、0.001)；Trp与eGFR、FK506 Cmin呈正相关(P=0.003、0.008)，与BUN、SCr呈负相关(P=0.006、0.002)；Arg与UA呈负相关(P=0.005)。见表3。

表2 血清氨基酸水平结果

注：*，△表示t检验；+，#表示Mann-WhitneyU检验。*和+表示ART组、AKI组与CHV组比较，P<0.05；△和#表示AKI组与ART组比较，P<0.05；**和++表示ART组、AKI组与CHV组比较，P<0.01；△△和##表示AKI组与ART组比较，P<0.01

表3 氨基酸水平及比值与临床生化指标的相关性分析

注：**表示P<0.01，*表示P<0.05

3 讨 论

肾脏在人体新陈代谢过程，扮演着一个重要的角色，即参与合成和降解生物活性代谢物质，如氨基酸、脂肪酸、糖类等。肾功能受损，如急性肾损伤、终末期肾病等则影响着人体正常生理机能。尿素、肌酸酐都是尿素循环中的直接或间接产物，是体内氨基酸及蛋白质的代谢废物，通过肾脏代谢和排泄。

SDMA作为Arg的同系物，参与人体内尿素循环，其水平变化受肾脏功能和结构影响，也影响肾脏的生理功能。研究证明，在细胞内S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体的条件下，含有Arg残基的蛋白质经过蛋白精氨酸甲基转移酶类Ⅱ的作用发生甲基化，甲基化的蛋白质再经过水解产生SDMA，但SDMA主要代谢途径是经过肾脏排泄[11]。SDMA通过抑制碱性氨基酸转运载体而间接作用于一氧化氮合酶(NOS)，从而间接抑制着Arg[11-12]。急性肾损伤患者，排泄尿量急剧锐减，使得SDMA不能随尿液排泄，导致体液循环中SDMA水平增加，间接引起NO减少，造成心血管系统、神经系统炎症和免疫系统等生理机理紊乱。FLECK等[13]回顾分析发现，肾移植术后患者的SDMA与SCr存在着极强的线性相关(R2=0.94，P<0.001)。结合本文研究进一步证明，血清SDMA水平与肾脏病理损伤程度(SCr、eGFR、BUN等)的关系甚为密切。

体内Trp主要代谢途径是通过吲哚胺-2，3-双加氧酶(IDO)代谢生成Kyn，再经过一系列反应，最终生成犬尿酸、黄尿酸和CO2等经肾脏排出。IDO是肝外组织唯一可催化Trp分解产生Kyn的限速亚铁血红素酶[14]。在正常生理状态下，IDO一般处于低水平表达，而当机体处于疾病状态时，体内产生的因某些因子如干扰素γ、白细胞介素-10等促使并加速IDO表达，加速生成Kyn的代谢途径，导致Trp匮乏[15]。SCHEFOLD等[16]在评估慢性肾脏病患者的肾功能状态时，随着慢性肾脏疾病等级的加重，血清中的IDO活性表达增强，导致Kyn水平呈上升趋势，而Trp水平逐渐下降。同时，本研究也证明，使用FK506导致的急性肾损伤组Trp水平明显比肾移植术后使用FK506表现正常者组和健康志愿者减少，而Kyn水平恰好相反；并且血清Trp与肾脏病理损伤程度(SCr、eGFR、BUN等)的相关性也比较密切。

4 结 论

机体内某些氨基酸，如SDMA、Trp和Kyn的代谢变化极有可能与肾移植术后使用免疫抑制(FK506等)引起的药源性肾损伤过程及病理损伤程度呈密切相关性。因此，血清氨基酸的水平测定可以反映患者氨基酸的代谢变化及疾病的进展与愈后情况，对于药源性肾损伤的早期干预有一定的指导作用，并且还可进一步弥补临床上现有生化诊断指标的缺陷与不足。但本研究为回顾性分析，选取的样本量较小，SDMA、Trp和Kyn的水平测定价值还需要大规模的、深层次的和前瞻性试验数据支持。