徐州地区0～8岁儿童尿液HCMV-DNA结果分析

宋子威，张 微，刘志坚，李 颖，李世宝,3△

(1.徐州医科大学附属医院检验科,江苏徐州 221002；2.徐州市泉山社区卫生服务中心检验科,江苏徐州 221002；3.徐州医科大学医学技术学院,江苏徐州 221002)

人巨细胞病毒(HCMV)属于β疱疹病毒亚科，具有严格的种属特异性和潜伏-活化的生物学特性，属于人类普遍易感的常见病原体之一。原发感染以婴幼儿时期为主，大多为无临床症状的潜伏感染[1]。HCMV是引起先天性及围生期感染的重要病原体，可通过胎盘、产道、母乳或密切接触直接传播给婴儿，导致死胎、流产、早产、生长发育迟缓、畸形及迟发的智力低下、听力损害等不良妊娠结局[2-3]，严重影响新生儿的健康。在器官移植、恶性肿瘤、采用免疫抑制剂治疗等免疫功能低下者中，HCMV感染甚至可以引起患者死亡[4]。为了解徐州地区儿童HCMV的感染情况，现对2017年1月至2018年12月检测结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2017年1月至2018年12来徐州医科大学附属医院就诊的疑似HCMV感染患儿1 095例为研究对象。其中男676例，女419例，男女比例为1.61∶1；年龄0 d至8岁，中位年龄4个月。对患儿尿液及其母乳分别进行HCMV-DNA检测，尿液1 095份，母乳108份，尿液和母乳配对样本105份。

1.2仪器与试剂 ABI7500实时荧光定量PCR(qPCR)仪、Eppendorf高速冷冻离心机、Eppendorf金属浴恒温器、Eppendorf漩涡振荡仪；HCMV-DNA qPCR试剂盒，购自上海之江生物科技股份有限公司。

1.3方法

1.3.1标本采集与处理 尿液样本：无菌试管留取患儿1 d内3次混合尿液5.0 mL，充分混匀后吸取尿液1.0 mL于1.5 mL的无菌离心管中，12 000 r/min 离心10 min，弃上清；沉淀加无菌生理盐水1.0 mL混匀，15 000 r/min 离心5 min，弃上清；沉淀加入50 μL核酸抽提液漩涡混匀，100 ℃干浴10 min，使病毒颗粒完全裂解，然后13 000 r/min离心10 min，保留上清备用。乳汁样本：清洁乳头后用自我挤压法挤出约5 mL乳汁入无菌试管中，3 000 r/min离心5 min，吸取脂质下层乳清1.0 mL于1.5 mL的无菌离心管中，12 000 r/min离心10 min，弃上清；沉淀加入50 μL核酸抽提液漩涡混匀，100 ℃干浴10 min，使病毒颗粒完全裂解，然后13 000 r/min离心10 min，保留上清备用。

1.3.2qPCR扩增 取4 μL DNA模板加入定量PCR反应液中，放入ABI 7500 qPCR仪进行扩增。扩增条件为37 ℃ 2 min，94 ℃ 2 min，1个循环；93 ℃ 15 s→60 ℃ 1 min，40个循环；单点荧光采集在60 ℃。每次试验设置阴性、阳性对照。

1.3.3结果判读 PCR反应结束后，电脑根据标准曲线自动分析计算检测结果。HCMV-DNA载量以基因拷贝/毫升表示，HCMV-DNA>500拷贝/毫升为阳性。

1.4统计学处理 数据采用SPSS17.0软件进行统计分析，计数资料以例数或率表示，组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1不同性别患儿尿液HCMV-DNA检测结果 1 095例患儿中阳性348例(31.78%)；阴性747例(68.22%)。其中男童阳性219例，阳性率32.40%；女童阳性129例，阳性率30.79%，男女阳性率比较差异无统计学意义(χ2=0.308 8，P=0.578 4)。

2.2不同年龄段患儿尿液HCMV-DNA检测结果 169例不足1月龄患儿中仅1例阳性；1月龄之后阳性率逐渐升高，在5～6月龄升至最高，为55.74%，1～2月龄、3～4月龄、5～6月龄3个年龄段阳性率两两比较差异均有统计学意义(χ2=15.429 2、59.516 6、14.448 5，均P<0.001)；7～12月龄阳性率与5～6月龄比较变化不大(χ2= 0.076 8，P=0.781 7)；随着年龄增长阳性率逐渐降至4.88%(χ2=19.709 6，P<0.001)。见表1。

表1 0～8岁患儿各年龄段尿液HCMV-DNA检测结果

2.3不同季节患儿尿液HCMV-DNA检测结果 春季(3～5月份)、夏季(6～8月份)、秋季(9～11月份)、冬季(12～次年2月份)阳性率分别为31.77%、31.20%、29.34%、33.16%，差异无统计学意义(χ2<0.001，P>0.05)。见表2。

表2 0～8岁患儿各季节尿液HCMV-DNA检测结果

2.4不同居住地患儿尿液HCMV-DNA检测结果 576例来自农村的患儿阳性216例，阳性率为37.50%；519例来自城镇的患儿阳性132例，阳性率为25.43%。两组阳性率差异有统计学意义(χ2=18.334 3，P<0.001)。

2.5108例母乳HCMV-DNA检测结果 108例母乳样本中HCMV-DNA阳性45例，阳性率为41.67%。在105例母子配对样本检测中，患儿尿液HCMV-DNA阳性的57例中母乳阳性40例，占70.16%；患儿尿液HCMV-DNA阴性的48例中母乳阳性4例，占8.33%，差异有统计学意义(χ2=40.934 7，P<0.001)。见表3。

表3 105例母子配对样本HCMV-DNA检测结果(n)

2.6尿液HCMV-DNA阳性患儿疾病分布 患儿HCMV感染的相关疾病以呼吸道感染为主，其中支气管炎/肺炎所占比例最大(59.20%，206/348)，其次为急性上呼吸道感染、肝炎综合征等。见表4。

表4 尿液HCMV-DNA阳性的相关疾病所占比例[n(%)]

3 讨 论

血清特异性抗体检测、尿液HCMV-DNA检测和血液HCMV-DNA检测是目前诊断HCMV感染的常用方法。临床上，IgG阳性多提示既往感染。由于可以通过胎盘，新生儿血清HCMV-IgG水平常反映母体抗体情况。HCMV-IgM抗体虽然能间接证实体内HCMV的存在，但是不可避免存在检测窗口期，并且患儿免疫功能低下，也会影响抗体生成的敏感性，导致假阴性的结果。在急性感染期，婴幼儿的泌尿道上皮细胞是HCMV最易侵袭的场所，此时病毒排量大，在尿液标本中稳定性好，而且与血清抗体相比，尿液HCMV-DNA检测快速、无创，易被患儿和家长接受，能作为判断药物疗效的定量指标。血液HCMV-DNA检测虽然和尿液HCMV-DNA检测一样，高浓度结果能提示患者体内HCMV处于活跃期并大量复制，但是灵敏度不如尿液HCMV-DNA检测[5-7]，而且属于有创检查，容易受到患儿和家属的抵触。由于肾小管排毒具有间歇性，大量饮水时尿液被稀释，检测结果阴性不能完全排除HCMV感染，临床上除了留取患儿多次混合尿液进行检测，联合血液HCMV-DNA检测是对患儿诊断HCMV感染的有效补充。

HCMV感染呈全球性分布。因社会经济发展水平、卫生条件和生活习惯的不同，不同国家甚至同一国家不同地区之间感染率也存在差异。发达国家儿童血清抗体阳性率约为50.41%；上海地区1～3岁儿童血清抗体阳性率为60.37%；南京地区0～8岁儿童血清抗体阳性率为82.40%；华中地区住院儿童血清抗体阳性率为88.11%[8-11]。本次调查共统计1 095例患儿，尿液HCMV-DNA阳性率约为32.00%，高于长沙地区健康婴幼儿18.49%的阳性率[12]，亦高于东莞地区患儿10.07%的阳性率[13]。此外，核酸阳性率远低于抗体阳性率，表明HCMV进入人体后大多以排毒量小于检测下线、仅产生特异性免疫应答而不产生临床症状的隐性感染和潜伏感染为主。HCMV感染与性别无关，无季节性，全年散发，冬季多密集，这与HCMV的感染特性一致。来自农村的患儿HCMV-DNA阳性率高于来自城镇的患儿，这提示HCMV感染与家庭条件和社会环境等密切相关；此外，生活方式的不断融合和统一使得城乡儿童的HCMV感染有逐渐接近的趋势。

HCMV感染在各年龄段均可发生，随着年龄增长，阳性率先升高后降低，且与新生儿期(0～28 d)相比，婴儿期(28 d至1岁)和幼儿期(1～3岁)阳性率明显较高。原因可能如下：经胎盘和母乳从母体获得高滴度的HCMV-IgG抗体，使得患儿感染HCMV后多表现为不产生感染性病毒的潜伏感染；随着患儿与外界环境的不断接触，HCMV在HCMV-IgG抗体阳性母亲的乳腺细胞中再激活及母源性抗体的消耗殆尽，导致发生活动性感染[14]；最后，随着患儿自主免疫的不断完善、垂直传播来源的不断清除及哺乳期的结束，活动性感染再次转变为潜伏感染。此外，本调查还提示该地区儿童HCMV感染在5～12月龄达到最高峰，这与吴美玲等[10]的研究发现不一致，可能由检测方法、地域差异以及抽样误差引起。

母乳喂养因优点众多一直受到大力提倡，然而近年来研究却发现母乳喂养是婴幼儿HCMV感染的重要途径之一，有调查称乳汁排毒率为13%～70%[15-16]。本调查共统计108例乳汁样本，HCMV阳性率为41.67%，低于国内报道的结果43.80%～81.63%，不排除与样本量少有关。尿检阳性患儿母乳的阳性率远大于尿检阴性患儿母乳的阳性率，高度提示母乳可能是患儿感染HCMV的重要途径之一。

HCMV感染往往缺乏临床特异性，但仍有部分感染患儿伴有不同程度的肺炎、肝脾肿大、血小板减少性紫癜等，黄疸亦可为其唯一表现形式。本调查结果显示，HCMV感染患儿以呼吸道感染居多，可能是因为婴幼儿呼吸系统发育不成熟，对病原体抵抗力差，不能充分咳嗽与咳痰；其次是肝炎综合征，提示肝脏是HCMV的重要靶器官之一。HCMV肝炎患儿肝脏肿大程度比乙型肝炎病毒等嗜肝病毒所致的肝脏肿大明显，病情轻重不一，大多数治疗后预后良好，少数重症可发展为肝硬化、腹水。此外，HCMV感染还伴有不同程度的肠炎、血小板减少等，更有部分患儿多个系统同时受到影响。由于胃肠道抵抗力差、喂养不当，婴幼儿容易出现小儿肠炎。最新资料表明，HCMV感染与血小板减少、神经系统发育落后密切相关[17]，而患儿粒细胞减少很有可能是抗HCMV药物所导致的骨髓抑制，但这种不良反应通常可以逆转，必要时给予升白细胞等措施能达到良好的治疗效果。上述研究结果提示儿科医生在临床诊疗中对HCMV感染要有足够的重视，及时进行检测，及早进行干预。

4 结 论

徐州地区儿童HCMV感染率较高，感染高峰集中在5～12月龄，需要加强母婴HCMV感染的防控工作。婴幼儿感染HCMV可引起多系统受累及一系列临床表现，当患儿出现原因尚不明确的上述症状时，及时进行尿液HCMV-DNA检测对早期诊断具有重要意义。