改良比色法在全自动生化分析仪加样重复性与准确度校准中的应用

王志伟，蔡永梅，毛东英，刘 京，杨 萍，王利新△，闫 鹏

(1.宁夏医科大学总医院医学实验中心，宁夏银川 750004；2.西门子医学诊断产品(上海)有限公司，上海 200120)

样本和试剂加注重复性和准确度测定是全自动生化分析仪校准过程中的难点[1]，采用称量法需控制仪器试剂针或样品针将特定体积的液体转移至指定容器，用电子天平称量并计算所转移液体的体积[2]。然而,多数全自动生化分析仪并不支持上述液体转移的特定测试序列且在实验室环境进行微量称量受干扰因素较多，可操作性差。传统的比色法理论上可对样本的加注情况进行测定，然而主流的全自动生化分析仪首先加入比色杯的是试剂一而不是样本，且两者加注间隔时间非常短，采用比色法对其中之一进行测定难度很大。比色法通过加注、回收和定容，稀释所加注色素原液、确定稀释倍数，测定稀释后色素原液与内标物吸光度，计算色素原液加注体积。基于此，笔者对比色法进行改良，在全自动生化分析仪设定特定的检测程序，对吸光度已知的标准物质进行稀释，测量稀释后的吸光度并与理论吸光度值进行对照，测定样本和试剂加注的重复性与准确度。现报道如下。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂 西门子ADVIA 2400全自动生化分析仪；BW 2025-1生化分析仪校准用溶液标准物质-吸光度[3-4]，由中国计量研究科学院提供。

1.2方法

1.2.1参数设置 在西门子ADVIA 2400全自动生化分析仪开放通道按表1要求定义检测方法。其中ORIGI-1对标称为0.981A的生化分析仪校准用溶液标准物质-吸光度BW 2025-1进行测定，确定标准物质在该仪器检测时的准确吸光度；S-25、S-5和S-2分别对25、5、2 μL的样本加注量进行测量；D-STD和D-SPE分别对30、5 μL原样量加注、稀释情况进行测量；R1-50和R2-10对试剂一常用加注量50 μL及试剂二常用加注量10 μL进行测量。见表1。

1.2.2水参比测试 不同稀释条件下测定BW 2025-1吸光度均以去离子水作参比，因此，确认项目参数设置无误后，同时以去离子水为试剂和样本运行所有项目定标，获得水参考吸光度。注意，不能以试剂空白代替水参考。见表2。

1.2.3获取吸光度 正确获取水参比后，按表2所示要求放置样本和试剂，运行所有检测项目20次，读取吸光度值。表中标准物为BW 2025-1，稀释液为0.05 mol/L硫酸。

2 结 果

读取各测试程序吸光度值后，分别计算其均值、标准差及变异系数，评估试剂和样本加注的重复性，所有测试项目变异系数均处于2% 的允许变化范围之内[2]。根据BW 2025-1在仪器测定均值及BW 2025-1被稀释的比例计算各测试项目的理论吸光度值，结合各项目20次测定均值计算误差，评估试剂和样本加注的准确度，所有测试项目误差均处于±5%的允许范围内[2],试验仪器样本与试剂加注的重复性和准确度均满足要求，见表3。

表1 测试方法参数设置

表2 各测试方法样本、试剂要求

表3 各测试方法吸光度重复性与准确度

续表3 各测试方法吸光度重复性与准确度

注：-表示此项无数据

3 讨 论

不同生化分析仪比色杯光径存在差异，标准物质上机检测时读取的吸光度亦不同[5-6]。在进行加样准确度和重复性测试前应当设置程序获得标准物质实测吸光度值，该测定结果不依赖于试剂或样本加注的准确度和重复性，且20次测定的变异系数应当小于1.50%[2]。所有测试程序加注液体的总量均不得低于仪器最小标称反应体积。改良的比色法实质是将标准物质BW 2025-1按照特定比例稀释检测吸光度，稀释倍数不宜过大，稀释倍数过大(如大于50倍或100倍)导致BW 2025-1过度稀释，获得的吸光度值过低、接近仪器吸光度分辨率而产生测量误差。BW 2025-1的基体为0.05 mol/L硫酸，不宜用去离子水作为稀释剂。实际上，也可用吸光度已知、状态稳定的染料或色素原液代替标准物质BW 2025-1，对传统的比色法进行改良，实现全自动生化分析仪样本与试剂加注准确度和重复性的测试。在进行样本(或试剂)加注测试时，应当将试剂(或样本)的加注量设为最大，降低不确定度的引入；在进行仪器最小加样量测试时，应当兼顾最小反应体积和稀释比例，合理设置参数。运行测试前进行水参比测试也是必须的，否则测得的吸光度与稀释倍数不相关，无法进行加注准确度判断。为避免温度和放置时间对标准物质BW 2025-1影响，所有测试均应尽可能在同一时间、同一批次完成。

校准前应当对生化分析仪作必要的维护[7]，如检查液体管路，更换注射器密封组件，必要时更换样本或试剂针，确保仪器工作状态良好；样本加注重复性和准确度测试点(校准点)选择25 μL(最大)、2 μL(最小)及5 μL；样本稀释重复性和准确度测试点(校准点)选择30 μL(30∶150，STANDARD，常用)及5 μL(5∶75，微量)；试剂加注重复性和准确度测试点(校准点)选择试剂1常用加注体积50 μL及试剂2常用加注体积10 μL。所有校准点的选择须兼顾样本或试剂的常用加注体积以保证校准测试的有效性。该方法除用于定期校准测试外，还可用于生化分析仪样本或试剂分配系统故障的排查，亦可结合反应曲线对试剂混匀情况进行测试。

生化分析仪加样准确度与重复性测试的首选方法是称量法，但是称量法实现的前提是仪器能够提供特定的测试程序予以支持，加之受实验室的环境、称量设备、人员素质等因素的限制，称量法在实验室实施并不可行且操作不当有可能引入很大的不确定度，不能真正考察仪器试剂和样本的加注准确度和重复性[3,8-9]。采用改良比色法，只需设定测试程序、运行实验、统计分析数据即可完成生化

分析仪加样系统的校准，对人员、环境条件、设备等要求较低，简单易行[8,10]。

4 结 论

合理设置分析方法，使全自动生化分析仪按照特定比例对标准物质BW 2025-1进行稀释，改良传统比色法，可实现全自动生化分析仪试剂与样本加注重复性和准确度的测试、评估(校准)。该方法简单、便于操作，受影响因素少，可操作性强[9-10]。