血清APE1蛋白检测在食管癌诊断中的价值

2019-11-27罗家敏杨宇馨张诗珩熊艳丽单锦露李梦侠

国际检验医学杂志 2019年22期

罗家敏，戴楠，陈川，杨宇馨，张诗珩，熊艳丽，单锦露，王阁，李梦侠，王东

(中国人民解放军陆军特色医学中心肿瘤中心，重庆 400042)

食管癌是常见的消化道恶性肿瘤，在我国发病率和病死率分别位居第6位、第4位[1]。早期食管癌预后较好，5年生存率>90%[2]，但因早期食管癌症状多不典型，易被忽略，大多患者就诊时已为晚期，5年生存率为15%～25%[3]。因此，早发现、早诊断、早治疗是食管癌临床诊治的关键。目前，食管癌的诊断主要依赖内镜下组织病理学检查，但由于其属于侵入性检查且检查费用较高，不适用于临床筛查。血清肿瘤标志物容易获取，且在某些肿瘤患者中具有较高的灵敏度及特异度，成为筛查及早期诊断恶性肿瘤的一个重要辅助手段。目前，食管癌常用的血清肿瘤标志物有鳞状细胞抗原(SCCA)、糖类抗原19-9(CA19-9)、细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)、癌胚抗原(CEA)、糖类抗原242(CA242)等。然而，由于它们诊断灵敏度和特异度较低，在早期食管癌检测中的价值有限，所以，有待寻求具有更高诊断灵敏度和特异度的新型肿瘤标志物。

脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶 1(APE1)是广泛存在于人体组织中的一种多功能酶。它不仅是参与DNA损伤后碱基切除修复途径的限速酶，亦具有氧化还原功能，调控人体多种重要细胞转录因子活性[4-5]。研究发现，APE1的调节异常与癌症的发生、发展及预后相关，在肺癌、肝癌、结肠癌、食管癌等多种恶性肿瘤组织中均发现APE1的高表达[6-12]。然而，关于恶性肿瘤患者血清中APE1水平的研究较少。KATSUMATA等[13]首次在系统性红斑狼疮患者血清中发现APE1抗体水平明显高于健康对照组。基于该发现，本实验组推测APE1蛋白在其他病理状态的患者血清中亦可能存在高表达，并进行相关研究发现在非小细胞肺癌患者血清中存在APE1蛋白及其抗体的高表达，且其表达水平与化疗疗效相关[14]。因此，本研究通过酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测食管癌患者血清中APE1水平，并运用Logisitic回归和受试者工作特征曲线(ROC曲线)等统计方法，分析APE1联合CEA、CA19-9和CA242后的诊断效能，以探讨血清APE1蛋白检测在食管癌诊断中的意义。

1 资料与方法

1.1一般资料收集2010年1月至2012年8月本院共297例食管癌患者(病例组)血清，其中男255例，女42例，年龄41-85岁，中位年龄65岁，所有患者均为经组织病理学确诊的初治患者，并排除合并严重创伤、感染、自身免疫疾病及半年内手术史、其他恶性肿瘤病史患者。另同期收集312例体检健康人群血清作为对照组，其中男104例，女208例，年龄25～89岁，中位年龄62岁。收集两组人群性别、年龄、吸烟史、饮酒史、肿瘤家族史、临床TNM分期等相关临床资料。297例食管癌患者与312例健康对照人群年龄、性别、吸烟史、饮酒史、肿瘤家族史差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

1.2血清APE1检测所有标本为受试者清晨空腹静脉血，室温凝血后以3 000 r/min离心10 min，收集无溶血的血清标本，-80 ℃条件贮存。实验采用血清APE1定量检测试剂盒,由本实验室与天津华博特生物科技有限公司联合研发，实验具体步骤如下。(1)配制蛋白标准品：蛋白原液3.1 mg/mL，配制液为试剂盒提供的封闭缓冲液，水平为0.0、0.1、0.4、1.6、4.0、8.0 ng/mL。(2)孵育血清：分别将蛋白标准品与待测血清原液加入微孔板，平板振荡，随后在37 ℃恒温箱中盖板孵育，时间为60 min。(3)洗板：倒掉反应液后每孔以200 μL清洗液洗板5次，并控干孔内残液。(4)每孔加入100 μL酶结合物并振荡混匀，37 ℃恒温箱中盖板孵育60 min。(5)同步骤3洗板。(6)加底物液：每孔加入100 μL混合后的底物液显色，37 ℃恒温箱中温育15 min。(7)终止及读值：每孔加入终止液50 μL进行终止，终止反应后10 min内在测定波长450 nm、参比波长620 nm条件下测定吸光度值。利用插值法(0ringin9.0 软件)计算血清APE1水平。

表1 病例组与对照组一般临床资料[n(%)]

1.3血清CEA、CA242、CA19-9检测所有血清均采用本院常规肿瘤诊断蛋白芯片试剂盒进行检测，试剂盒购自浙江湖州数康生物科技有限公司。正常参考范围如下：血清CEA<5 ng/mL，CA19-9<37 U/mL，CA242<20 IU/mL。检测结果高于正常参考值时判定为阳性病例。APE1联合其他肿瘤标志物检测时，结果中只要有一项为阳性，该样本即判定为阳性。

2 结果

2.12组人群血清APE1水平差异病例组血清APE1水平范围为0～6.379 0 ng/mL,中位水平为0.322 6 ng/mL，对照组血清APE1水平范围内0～1.374 2 ng/mL,中位水平为0.215 1 ng/mL，病例组的血清APE1水平明显高于对照组(P<0.001)。

2.2绘制ROC曲线评价血清APE1在食管癌诊断中的价值分别绘制血清APE1、CA19-9、CEA及CA242的ROC曲线，APE1的曲线下面积(AUC)最大，为0．661(95%CI:0.616～0.706)。其次是CEA，AUC为0.620(95%CI:0.574～0.665),见图1A。APE1的临界值值为0.32 ng/mL，此时APE1诊断食管癌的灵敏度为50.2%，特异度为91.9%。利用Logistic回归模型，计算血清APE1联合CEA、CA19-9及CA242的诊断预测概率，APE1与CEA及CA242联合后的AUC较单一指标升高，其中APE1与CEA联合后AUC最大,为0.739(95%CI：0.696～0.781)，见图1B。

注：A表示血清APE1、CEA、CA19-9、CA242的ROC曲线；B表示血清APE1与CEA、CA19-9 、CA242分别联合的ROC曲线

图1单独和联合检测的ROC曲线

2.3病例组血清APE1水平与临床因素的相关性分析297例食管癌患者血清APE1水平与性别、年龄、吸烟史、饮酒史、肿瘤家族史及TNM分期的相关性，结果显示Ⅲ+Ⅳ期患者的血清APE1水平显著高于Ⅰ+Ⅱ期患者，提示血清APE1水平与TNM分期关系密切，而与性别、年龄等其余临床因素无相关性。见表2。

表2 病例组血清APE1水平与临床因素的相关性

2.4多因素Logistic回归分析食管癌患者的血清APE1水平纳入年龄、性别、吸烟史、饮酒史、家族史行多因素Logistic回归分析，结果表明血清APE1、CEA水平和年龄是食管癌发病的危险因素，APE1的OR值为25.646(95%CI:10.179～64.617)；CEA的OR值为1.262(95%CI:1.158～1.374)；年龄的OR值为1.086(95%CI:1.064～1.109)。

2.5APE1、CEA、CA19-9及CA242对食管癌诊断效能的比较 CA242在食管癌诊断中灵敏度最高，但特异度较低。APE1诊断灵敏度及特异度其次，但其准确度在各单项指标中位居第一。APE1与CEA、CA19-9、CA242联合后，灵敏度及准确度有所升高，特异度有所下降,见表3。

3 讨论

恶性肿瘤的早发现、早诊断是影响预后的重要因素，目前食管癌的早期诊断主要依靠有创性的内镜检查，操作不便且价格昂贵，寻求一种易于检测且灵敏度高的肿瘤标志物成为研究热点。APE1作为DNA损伤修复途径的重要限速酶，近年来，已有多项研究证实其在非小细胞肺癌、结肠癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、骨肉瘤、食管癌等多种恶性肿瘤组织中存在异常表达，表现为表达水平增高及胞质异位表达，因而APE1被认为是多种恶性肿瘤的组织标志物。笔者推测，APE1异常表达的肿瘤组织，在大量肿瘤增殖、凋亡、坏死的过程中，细胞分泌或裂解释放APE1蛋白入血，从而可能从血清中检测到异常表达的APE1蛋白。本研究检测297例食管癌患者和312例体检健康者血清APE1蛋白水平，发现食管癌患者血清APE1水平显著高于健康对照人群，提示检测食管癌患者血清APE1水平可辅助诊断食管癌。且运用ELISA方法进行检测，较组织病理学检查具有快速、简便、重复性高、费用低廉的优点。另外，本研究发现APE1水平与肿瘤分期密切相关，Ⅲ+Ⅳ期食管癌患者的APE1水平显著高于Ⅰ+Ⅱ期患者，这可能与晚期患者肿瘤负荷更大，肿瘤细胞凋亡、坏死更多有关。

本研究中，血清APE1单独诊断食管癌的灵敏度为50.2%，特异度为91.9%，准确度为67.8%，提示血清APE1可作为食管癌较为优秀的血清学诊断指标。进一步分析APE1联合CEA、CA19-9及CA242检测，联合后虽诊断特异度有所下降，但灵敏度与准确度提高，提示APE1和现有的肿瘤标志物联合检测可以提高食管癌的诊断效能，但仍需更大样本量的验证以确定最佳联合检测模式及APE1最佳参考值范围。

我国食管癌以食管鳞癌为主，既往研究证实SCCA、CYFRA21-1在食管鳞癌患者血清中表达升高，但其诊断食管癌的灵敏度较低，分别为32.0%和47.9%[15]。参考既往研究提示其诊断灵敏度欠佳，故在本研究中未将SCCA、CYFRA21-1列入。根据本研究结果提示APE1与CEA、CA19-9等联合检测可提高诊断效能这一趋势，推测APE1与SCCA、CYFRA21-1联合检测食管癌亦可能较单独检测更具优势，在未来的研究中可行进一步探讨。本实验尚未获得食管癌患者治疗效果及生存期等相关数据，血清APE1是否可作为食管癌患者治疗反应监测及预后判断的辅助参考指标，仍待进一步研究。