杏仁皮单宁提取工艺优化及其DPPH自由基清除活性

杜 凯,马养民,2,*,郭林新

(1.陕西科技大学化学与化工学院,陕西西安 710021;2.陕西省轻化工助剂重点实验室,陕西西安 710021)

山杏(Armeniacasibirica)又名西伯利亚杏,蔷薇科杏属植物,广泛分布于我国北方地区,是改善生态环境、提高经济效益和社会效益的经济资源树种[1]。由于杏仁具有镇咳平喘、润肠通便、抗炎镇痛的效果及抗肿瘤、降血糖、抑制胃蛋白酶活性等药理作用[2-3],杏仁加工产品的种类和数量快速增加,作为杏仁产业的下脚料杏仁皮也越来越多,这已经成为杏仁加工企业很难处理的苦恼问题。目前研究主要集中在杏仁皮黄酮、黑色素、果胶等方面[4-6],而杏仁皮单宁相关的研究还未见报道。

单宁是一类分子量为500～3000的多元酚类化合物,广泛存在于植物的果、叶、皮中[7]。单宁可以与蛋白质结合产生沉淀[8],广泛应用于医疗、皮革和化妆品等行业[9-10]。有关山杏单宁的研究鲜有报道,且仅限于其叶片单宁的提取及单宁成分的分析检测[11-13]。经过前期预试验发现杏仁皮中富含单宁,杏仁皮作为工业生产的废弃资源,尚未被开发,如能将其加以利用,将会带来极大的社会经济效益。

本研究以杏仁加工企业所产生的废弃物杏仁皮为原料,进行单宁的提取,旨在建立一条最优的杏仁皮单宁提取工艺,并对其单宁抗氧化活性进行初步测试,为资源充分开发利用提供一定的数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

杏仁皮 陕西天寿杏仁食品有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH自由基) 上海华蓝化学科技有限公司;维生素C 天津博迪化工有限公司;其余试剂均为国产分析纯。

HF200型酶标仪 北京华安麦科生物技术有限公司;R502B型旋转蒸发器 上海申生科技有限公司;DK-98Ⅱ型电热恒温水浴锅 上海申生科技有限公司;SHZ-Ⅲ型循环水式真空泵 上海申生科技有限公司;BS2202S电子秤 北京市科技电光仪器厂;BS224S型分析天平 格瑞恩科技发展有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 杏仁皮单宁提取 采用水浴回流法提取杏仁皮单宁[14]。称取5 g杏仁皮粗粉于圆底烧瓶中,加入一定体积分数的乙醇溶液,一定温度下回流提取一段时间,过滤,重复提取三次,合并滤液,将其真空浓缩后待测。

1.2.2 单宁得率的测定 采用络合法测定单宁得率[15]。取待测浓缩液加水约至60 mL于35 ℃水浴温热15 min。精密移取4.00 mL 1.000 mol/L醋酸锌溶液于100 mL容量瓶中,加入2.80 mL氨水,摇匀使白色沉淀溶解,缓慢加入已预热的待测浓缩液,边加边摇,加完后继续振摇1 min,置原水浴保温30 min,间歇振摇数次,待反应完毕,冷却至室温,定容,混匀后过滤,精密移取滤液10.00 mL于锥形瓶中,并加入150 mL水、12.5 mL pH=10的NH3-NH4Cl缓冲溶液和3滴铬黑T指示剂。以0.02631 mol/L EDTA·2Na滴定至溶液由酒红色变为蓝色。单宁得率按下式计算:

单宁得率(%)=[0.1556×(VZn×CZn-10×VEDTA×CEDTA)]/W×100

式中:0.1556指每毫升1 mol/L的醋酸锌溶液平均消耗单宁0.1556 g;VZn为移取锌离子体积量,mL;CZn为锌离子物质的量浓度,mol/L;VEDTA为EDTA消耗体积,mL;CEDTA为EDTA浓度,mol/L;W为样品的质量,g。

1.2.3 单因素实验 固定提取时间90 min、提取温度60 ℃、乙醇体积分数50%,考察料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 (g/mL)对单宁得率的影响;固定料液比1∶20 (g/mL)、提取温度60 ℃、乙醇体积分数50%,考察提取时间30、60、90、120、150 min对单宁得率的影响;固定料液比1∶20 (g/mL)、提取时间90 min、乙醇体积分数50%,考察提取温度40、50、60、70、80 ℃对单宁得率的影响;固定料液比1∶20 (g/mL)、提取时间90 min、提取温度70 ℃,考察乙醇体积分数30%、40%、50%、60%、70%对单宁得率的影响。

1.2.4 响应面实验 在单因素实验的基础上,以杏仁皮单宁的得率为响应值,以料液比、提取温度、提取时间、乙醇体积分数4个因素为自变量进行Box-Behnken响应面实验设计,优化杏仁皮单宁提取工艺,其实验因素与水平见表1。

表1 响应面实验因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.5 杏仁皮单宁抗氧化活性测试 采用DPPH法测定[16],用95%乙醇配制成浓度为0.2 mg/mL的DPPH溶液。将最佳工艺下所得的杏仁皮单宁配制成单宁浓度为0.5 mg/mL的待测液,同时以VC作阳性对照。用二倍稀释法得到待测液浓度依次为500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81 μg/mL,然后将待测液分别与DPPH溶液避光反应30 min,在517 nm处使用酶标仪测定溶液的吸光度。并通过下式计算DPPH自由基清除率。

式中:E为自由基清除率;A0为DPPH加乙醇的吸光度;A1为DPPH加样品的吸光度;A2为样品加乙醇的吸光度。

1.2.6 数据处理 所有实验重复三次,取平均值。Origin 9.0软件进行绘图,SPSS 21.0软件的单因素方差进行变量之间差异的统计分析(当P<0.05时,差异显著)。使用Design-Expert V 8.0.6软件进行响应面数据分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果和数据分析

2.1.1 料液比对杏仁皮单宁得率的影响 由图1可知,随着料液比的降低,杏仁皮单宁的得率显著(P<0.05)增加,当料液比到达1∶20 (g/mL)之后,得率还有微小的增加趋势,到1∶25 (g/mL)时已趋于稳定。这是由于溶剂用量的增加有利于单宁的提取,但达到一定比例后,大部分单宁已经被溶出,继续增加溶剂时,单宁得率增加不再明显,而且会造成溶剂的浪费。

图1 料液比对杏仁皮单宁得率的影响Fig.1 Effect of solid to liquid ratio on the yield of tannins

从成本与得率方面考虑,选择料液比范围为1∶18～1∶24 (g/mL)为宜。

2.1.2 提取时间对杏仁皮单宁得率的影响 由图2可知,提取时间在30～90 min之内单宁得率随时间的延长而增加,当提取时间为90 min时单宁得率达到最大值1.62%,而提取时间继续增加时单宁得率有所降低。原因可能是单宁属于多酚类化合物,其结构不太稳定,随着提取时间的延长部分单宁变性导致[17-18]。综合考虑,后续提取时间控制在70～110 min较为合适。

图2 提取时间对杏仁皮单宁得率的影响Fig.2 Effect of extraction time on the yield of tannins

2.1.3 提取温度对杏仁皮单宁得率的影响 由图3可知,提取温度在40～70 ℃时,单宁得率随温度的升高而增加,70 ℃时单宁得率达到最高值为1.83%,这可能是由于分子运动速度随温度的升高而加快,植物中氢键也随之断裂。当温度达到80 ℃时,单宁的热不稳定性使单宁得率降低[17]。因此,提取温度控制在60～80 ℃为宜。

图3 提取温度对杏仁皮单宁得率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of tannins

2.1.4 乙醇体积分数对杏仁皮单宁得率的影响 由图4可知,乙醇的体积分数对单宁得率影响较大。当乙醇体积分数在30%～50%时,单宁得率由1.32%增加到2.11%;在乙醇的体积分数为50%时,达到最高值;当乙醇体积分数在50%～70%时单宁得率不断下降。这可能是极性过大时,乙醇用量较低,则无法断裂单宁与多糖、蛋白质间的氢键;极性过小时,无法充分溶解单宁类成分[19]。综合考虑,乙醇体积分数选择45%～65%比较合适。

图4 乙醇体积分数对杏仁皮单宁得率的影响Fig.4 Effect of ethanol volume fraction on the yield of tannins

2.2 响应面实验结果和数据分析

2.2.1 Box-Behnken实验设计及分析 在单因素基础上,以料液比(A)、提取时间(B)、提取温度(C)、乙醇体积分数(D)为考察因素,单宁得率(Y)为指标,利用Design-Expert V 8.0.6软件设计四因素三水平的响应面实验,结果见表2。对表2的实验结果进行线性拟合,得到回归方程:

Y=2.11+0.025A-4.167E-003B-0.011C-0.027D+0.010AB+0.015AD+0.015BC+2.500E-003BD-0.028CD-0.070A2-0.084B2-0.18C2-0.17D2

表2 响应面实验设计及结果Table 2 Response surface methodology design and results

表3 模型及方差分析结果Table 3 Results of model and variance analysis

响应面图可以用来分析多个因素对响应值的影响程度和两因素之间的交互作用。响应面的陡峭程度直观的反映了两因素的交互作用对响应值的敏感程度[20]。由图5知,乙醇体积分数和提取温度的交互作用下,曲面较陡,表明其交互作用显著,这与方差分析相一致。并且,预测最高值均在曲面中心区域内,表明该模型拟合度较好,可预测最佳实验结果[21]。

2.2.2 验证实验 利用Design-Expert V 8.0.6软件预测得到的杏仁皮单宁最佳提取工艺是料液比为1∶21.51 (g/mL)、提取时间为89.43 min、提取温度为69.73 ℃、乙醇体积分数为49.65%,单宁得率为2.12%。为了方便进行实验,调整最佳参数料液比为1∶22 (g/mL)、提取时间为89 min、提取温度为70 ℃、乙醇体积分数为50%。此实验平行三次,得出杏仁皮单宁得率为2.13%,与预测值接近。

图5 乙醇体积分数和提取温度交互作用对单宁得率影响的响应面图Fig.5 Response surface plots of the effects ofthe interaction between extraction temperatureand ethanol volume fraction on tannins extraction rate

2.2.3 DPPH自由基清除率测定结果 DPPH法是测试抗氧化活性常用的一种方法,其DPPH是一种稳定的自由基,在醇溶液中呈深紫色,它能够接受电子或氢自由基,成为稳定的抗磁性分子而褪色。因此,清除DPPH自由基的能力可以用来表示物质抗氧化活性的强弱[22]。如图6所示,在浓度小于250 μg/mL时,单宁的自由基清除率随浓度的增加呈上升趋势,其对DPPH自由基的清除作用低于VC阳性对照;当浓度达到250 μg/mL后,杏仁皮单宁对自由基的清除率趋于稳定,与VC相当,单宁的自由基清除率达到了98.65%,证明其具有较强的自由基清除作用。这可能与单宁的分子结构有关,它们能提供氢,与DPPH自由基发生反应生成稳定的DPPH-H,从而使溶液褪色[23-24]。

图6 VC及杏仁皮单宁对DPPH自由基的清除作用Fig.6 DPPH radical-scavenging activity ofVC and almond skin tannins

3 结论

本研究在单因素的基础之上,采用Box-Behnken响应面实验设计,对杏仁皮单宁得率的提取条件进行优化,建立了可靠的杏仁皮单宁提取的回归模型。得出杏仁皮单宁提取工艺的最佳条件是:料液比为1∶22 (g/mL)、提取时间为89 min、提取温度为70 ℃、乙醇体积分数为50%,进行三次验证实验得到单宁得率为2.13%,与模型预测值基本一致。对最佳工艺下提取的杏仁皮单宁进行抗氧化活性测试,发现其浓度为250 μg/mL时DPPH自由基的清除率达到了98.65%,证明杏仁皮单宁具有较强的抗氧化活性。本实验首次在食品企业的废弃物杏仁皮中提取得到单宁,建立可靠的工艺路线,并初步对其抗氧化活性进行评价,为后续有效开发利用杏仁皮单宁废弃资源提供基础。