响应面法优化粪肠球菌包被发酵培养基

郭建军,熊大维,曾 静,魏国汶,袁 林

(江西省科学院微生物研究所,江西南昌 330096)

粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)作为能在肠道黏附生长的乳酸菌[1],具有良好的生物安全性和优良的益生特性[2]。在肠内能抵抗低pH环境,比一些肠道“过路菌”有更强的排斥和竞争致病菌的定植[3],还可通过分泌细菌素等抗菌物质抑制致病菌[4],同时粪肠球菌可代谢产生对养殖动物有益的营养物质,如L-乳酸、氨基酸、维生素及酶,提高胃肠内营养水平[5],促进动物生长,提高饲料转化率[6]。粪肠球菌已逐步发展成为最具有应用前景的抗生素替代品[7-8]。但粪肠球菌的应用效果受多种因素的影响[9],如生理状态、饲喂方法、温度和菌制剂的保存时间等都极易使菌失活,丧失益生特性[7]。通过微胶囊技术包被益生菌[10],可有效增强微生物对高温、胃酸及胆汁等不良环境因子的抵抗能力,提高产品的稳定性[11],保护菌体细胞少受剪切力的影响,进而增强益生菌的益生作用[12]。

目前,针对微生物细胞的包被技术多为发酵后包被[13],存在微胶囊产品得率低、活菌保存量少、能耗和成本较高等问题[14],产品活菌含量较低、且粒径大小不均一,从而造成微胶囊产品包被效果不佳[15-16]。发酵前包被将微生物活菌包被于微胶囊内,能够使粪肠球菌在微胶囊微环境下大量增殖,保护细胞少受剪切力的影响,从而实现其高密度和高活性的目的[17]。王婷婷等[18]在发酵前进行包被,得到颗粒大小均匀、球形度好、大小均匀的微囊化屎肠球菌固态产品,明显提高了屎肠球菌在极端环境下的存活率,有效地防止了菌体失活[18]。闫颖娟等[19]采用响应曲面法对微囊化保加利亚乳杆菌高密度培养的培养基组成和培养条件进行优化,其细胞菌密度可达到3.18×1011CFU/g。张琳等[20]对粪肠球菌进行发酵前包被制备粪肠球菌胶囊,显著增强了其对高温环境的耐受性,延长产品货架期。有关粪肠球菌包被培养基的优化研究仍较少。

本研究以粪肠球菌为对象,以海藻酸钠-碳酸钙微胶囊体[20]进行包被,采用中心组合设计和响应面对其包被发酵培养基组成分和含量进行了优化,确定适宜粪肠球菌高密度包被培养的发酵培养基,以期为工业化生产优质的粪肠球菌微生态制剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

粪肠球菌EXW27 由江西省科学院微生物研究所南昌市应用微生物重点实验室从健康仔猪肠道黏膜上分离纯化的优势菌株[21],体外试验证明,该菌株对于畜禽具有优良的益生潜力;SYTO 9 绿色荧光核酸染料 美国英杰生命技术公司;酵母粉、蛋白胨、牛肉膏 安琪酵母股份有限公司;吐温80 生工生物工程(上海)股份有限公司;葡萄糖、柠檬酸氢二铵、乙酸钠、磷酸氢二钾 国药集团化学试剂有限公司;硫酸镁、硫酸锰 西陇化工股份有限公司;纳米碳酸钙 江西永发化工公司;海藻酸钠 青岛明月海藻集团有限公司;其他试剂均为国产分析纯。

SW-CJ-ID型单人净化工作台 苏州净化设备有限公司;LDZX-50KBS立升手轮型立式压力蒸汽灭菌器 上海申安仪表有限公司;SPX-250B-Z型生化培养箱 上海博迅实业有限公司;L204电子天平、pH计FE20 梅特勒-托利多仪器(上海)股份有限公司;5 L发酵罐 上海保兴生物设备工程有限公司;H2500R台式高速大容量冷冻离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司;Scientz-10N台式真空冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司;BX43生物显微镜 日本Olympus公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的制备 MRS 培养基(g/L):胰蛋白胨10.0 g、牛肉膏8.0 g、酵母粉4.0 g、葡萄糖20.0 g、柠檬酸铵2.0 g、K2HPO4·7H2O 2.0 g、NaAc·3H2O 4.0 g,Tween 80 1.0 mL、MgSO4·7H2O 0.60 g、MnSO4·H2O 0.25 g,将上述成分加入到1000 mL 蒸馏水中,加热溶解,调节pH为6.2,121 ℃灭菌15 min,需要时加入15 g 琼脂,用于活化菌种和种子培养以及活菌含量检测。包被发酵培养基:在MRS培养基上添加海藻酸钠 10 g、纳米碳酸钙20 g。

1.2.2 液体种子培养 将本实验室保存的菌种粪肠球菌EXW27在培养基上划线接种至斜面MRS培养基上活化,37 ℃恒温培养24 h,传代两次。从保藏斜面挑一环菌苔接于装有100 mL液体MRS培养基的250 mL三角瓶中,于37 ℃、120 r/min培养12 h。

1.2.3 包被发酵培养 将菌株种子液按3%(V/V)接种于装液量为70%的5 L小罐基础包被发酵培养基中,初始pH7.0,搅拌转速100 r/min,不通气,控制发酵温度37 ℃至发酵结束。

1.2.4 菌体形态观察 用活细胞核酸染色剂(SYTO9)对发酵培养的粪肠球菌进行染色,在荧光显微镜下通过颜色不同判断细胞的活力状态。

1.2.5 包被培养粪肠球菌培养基配方的优化

1.2.5.1 Plackett-Burman试验设计 根据前期单因素实验结果,选取葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、柠檬酸铵、K2HPO4·7H2O、NaAc·3H2O,Tween 80、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、海藻酸钠、纳米碳酸钙等12个对包被培养活菌含量影响较大的因素,通过Design Expert 8.0 软件进行N=16的Plackett-Burman试验设计(见表1),以包被培养活菌含量(R)作为响应值进行试验分析,从中筛选出对包被培养活菌含量影响显著的培养基组分。

表1 二水平部分因子设计的因素和水平Table 1 Factors and levels of two-level partial factorial design

1.2.5.2 最陡爬坡试验 根据Plackett-Burman试验得出的拟合方程中各显著性因素对响应值的影响,以实验值变化梯度方向为爬坡方向,根据各因素效应值大小确定变化步长,设计最陡爬坡试验(表5),快速逼近包被培养活菌含量最大区域。

1.2.5.3 响应面试验 对Plackett-Burman试验确定的因素,以最陡爬坡试验得到的中心点,运用Box-Behnken的中心组合设计原理,设计了3因素5水平共20个实验点进行响应面试验,因素水平表见表2。

表2 中心组合试验因素与水平Table 2 Factors and levels of Central Composite Design

1.2.5.4 验证试验 将菌株种子液按3%(V/V)接种于装液量为70%的5 L发酵罐微囊包被培养最适培养基中,初始pH6.5,搅拌转速100 r/min,不通气,37 ℃培养,每隔1 h取样。每次取样测其活菌浓度、发酵液pH,并以培养时间为横坐标,绘制菌株生长曲线。

1.2.6 微胶包被活菌数的测定 将样品加入0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH6.2)中搅拌30 min,使微囊包被的粪肠球菌破壁后进行活菌计数;用梯度稀释法稀释一定倍数后,取3个浓度梯度进行MRS培养基倾注平板,每个梯度设3个平行,37 ℃培养48 h计数,结果以CFU/mL或CFU/g表示。

1.2.7 包被培养粪肠球菌的贮存耐受性试验 将菌液8000×g离心15 min,弃去上清液,收集菌泥;离心所得的菌泥与含3%脱脂奶粉的0.2 mol/L柠檬酸溶液等质量混合均匀,置于-40 ℃预冻处理5 h以上,在冷凝温度<-60 ℃、真空度<15 Pa下冷冻干燥[22]。包被培养和游离培养的粪肠球菌冻干粉在37 ℃条件下贮存,分别于0、10、30、60、90 d取样,每个处理3个重复。采用平板计数法计算每克产品的活菌数,按照公式(1)计算不同培养方式下粪肠球菌冻干粉在贮存不同时间的存活率。

存活率(%)=(贮存不同时间后冻干粉活菌数/初始活菌数)×100

式(1)

1.3 数据处理

实验所用到的数据分析软件为Design Expert 8.0.6b及SPSS Statistics 17.0。

2 结果与分析

2.1 包被培养和未包被培养的粪肠球菌形态的比较

游离培养和包被培养的粪肠球菌镜检结果如图1所示。以MRS培养基培养的粪肠球菌EXW27细胞呈短链状,均匀分散游离在发酵液中,不聚团(图1A),以发酵培养基培养的粪肠球菌EXW27细胞聚集成团的形成微胶囊,囊内菌体密度较大,未出现破囊现象,菌体也没有明显泄漏,且所形成的微囊大小较均匀,成球形良好,界限明显(图1B)。这是因为,在含纳米碳酸钙和海藻酸钠的发酵培养基中,随着粪肠球菌的不断生长繁殖,产生了大量酸性代谢产物(如乳酸),被纳米碳酸钙中和并释放Ca2+,当Ca2+向周围扩散形成以海藻酸钙为主要成分凝胶薄膜,包裹于四周逐渐形成中空的球状微囊,粪肠球菌被固定在微囊之中,从而形成微囊包被培养粪肠球菌。以上结果说明,加入纳米碳酸钙和海藻酸钙后可以实现对粪肠球菌进行包被培养。

图1 游离培养和包被培养的粪肠球菌镜检结果(×100)Fig.1 Microscopy results of Enterococcus faecalisin free and encapsulated cultures(×100)注:A:在MRS培养基中游离培养的粪肠球菌;B:在发酵培养基中包被培养的粪肠球菌。

2.2 Plackett-Burman试验及其结果分析

表3 Plackett-Burman试验设计和结果Table 3 Experimental design and response of Plackett-Burman

表4 Plackett-Burman试验方差分析Table 4 ANOVA for the Plackett-Burman design

注:“*”表示对结果影响显著(P<0.05)。2.3 最陡爬坡试验结果

由表5可知,随着葡萄糖、海藻酸钠和纳米碳酸钙3个主要影响因素的变化,微囊包被活菌含量呈现先上升后下降的趋势,其中第4组培养基对应的微囊包被活菌含量达到了最大值,达到57.825×108CFU/mL,相应变量接近最大响应区域,所以选取第4组条件即葡萄糖 5.0%、海藻酸钠1.6%和纳米碳酸钙3.2%为中心点进行响应面试验。

表5 最陡爬坡试验设计及结果Table 5 Experimental design of steepestascent and corresponding results

2.4 响应面试验结果

通过最陡爬坡试验确定了主要影响因素的具体浓度的取值区间,以葡萄糖(X1)、海藻酸钠(X2)、纳米碳酸钙(X3)3个因素为自变量,粪肠球菌微囊包被培养活菌含量(R)为响应值,通过Design-expert 软件设计3因素5水平的中心组合设计试验,试验设计和结果如表6所示。

表7 响应面试验方差分析结果Table 7 Results of variance analysis of response surface experiments

注:*表示差异显著,P<0.05:**表示差异极显著,P<0.01。

表6 中心组合试验设计及结果Table 6 Design and results of central composite experiment

固定其中的一个因素,做另外两个因素交互作用的曲面图及等高线图,确定葡萄糖浓度、海藻酸钠浓度和纳米碳酸钙交互作用对菌株发酵培养活菌数含量的影响,结果如图2。由图2可知,葡萄糖、海藻酸钠和纳米碳酸钙两两交互作用的等高线图均呈椭圆形,说明其交互作用均显著。响应面图均为抛物面,都存在一个极大值点,只有在各因素浓度适宜的条件下,培养后粪肠球菌微囊包被培养的活菌含量才会达到最大值。

图2 各因素交互作用对粪肠球菌微囊包被培养的活菌含量影响的响应面及等高线Fig.2 Response surface plot and contour line ofinteractive effects of various factors onenveloped Enterococcus faecalis concentration

2.5 验证试验

如图2所示,响应面抛物线图形开口均向下,说明存在最大值,即响应面覆盖了最大值所在的区域。对回归方程求解最大值可得:当X1=-0.071、X2=0.897、X3=0.945,即葡萄糖为4.93%、海藻酸钠为1.87%、纳米碳酸钙为3.65%。由此可知,最适培养基组成为:葡萄糖4.93%、蛋白胨1%、牛肉膏0.8%、酵母粉0.3%、柠檬酸铵0.3%、K2HPO4·7H2O 0.2%、MgSO4·7H2O 0.06%、MnSO4·H2O 0.045%、NaAc·3H2O 0.6%、吐温80 0.1%、海藻酸钠 1.87%、纳米碳酸钙 3.65%。在此条件下,粪肠球菌微囊包被培养的预测活菌含量最大,为6.56×109CFU/mL。

最适培养基条件下菌株的生长曲线如图3所示。由图3可知,优化后培养基在包被培养过程中pH缓慢下降,下降速率显著低于优化前(P<0.05),培养20 h后pH仍保持在5.8以上,为粪肠球菌包被培养提供较稳定的pH环境;包被培养的粪肠球菌优化后培养基比优化前提前2 h进入对数生长期,且对数生长期菌体的生长速率明显高于优化前,在11 h时包被培养的活菌含量最高为6.83×109CFU/mL,与预测值误差仅4.12%,说明该模型能很好地模拟和预测实验结果,证实了模型的有效性。

图3 包被培养的粪肠球菌的生长曲线Fig.3 Growth curve of Enterococcus faecalisin encapsulated culture

2.6 包被培养的粪肠球菌冻干粉的贮存稳定性

由图4可知,游离培养得到的粪肠球菌冻干粉在37 ℃条件下贮存,活菌数急速下降,在10 d存活率降至1.2%;而包被培养得到的粪肠球菌冻干粉在37 ℃条件下贮存10 d内活菌数没有明显下降,90 d后存活率为82.3%,说明包被发酵粪肠球菌冻干粉具有很好的稳定性和较长的货架期,这为今后粪肠球菌包被发酵的工业化生产及推广应用提供了依据。

图4 冻干菌粉在37 ℃条件下的贮存试验Fig.4 Results of freeze-dried bacteriapowder accelerated storage test at 37 ℃

3 结论

形态观察结果表明,在含纳米碳酸钙和海藻酸钠的发酵培养基中,随着粪肠球菌繁殖产生的酸性代谢产物与纳米碳酸钙和海藻酸钠反应,形成以海藻酸钙为主的凝胶薄膜将粪肠球菌固定在微囊之中,囊内充满大量菌体细胞聚集成团,微囊大小较均匀,成球形良好,界限明显。通过Plackett-Burman 试验设计筛选出葡萄糖、海藻酸钠和纳米碳酸钙 3 个对粪肠球菌包被培养活菌含量影响显著(P<0.05)。进一步优化得到的包被发酵培养基最佳组成为:葡萄糖4.93%、海藻酸钠1.87%、纳米碳酸钙3.65%。对包被培养优化后培养基进行了验证试验,整个培养过程中pH维持在5.8以上,包被培养的粪肠球菌活菌达6.83×109CFU/mL,与预测值误差仅4.12%,是优化前的2.88倍。在粪肠球菌冻干粉的贮存稳定性试验中发现,包被培养的粪肠球菌冻干粉在37 ℃条件下贮存10 d内活菌数没有明显的下降,90 d后活菌仍保留80%以上的存活率,说明包被培养粪肠球菌冻干粉具有较高的稳定性和较长的货架期,为粪肠球菌微生态制剂产品的开发提供理论依据。