一株产细菌素植物乳杆菌高密度发酵培养基的筛选及其在酸奶中的应用

贺 菁,周金雨,刘瑞娜,梁 玉,侯雨佳,孟祥晨

(东北农业大学乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨 150030)

植物乳杆菌是一类革兰氏阳性乳杆菌属,是国内外公认的食品加工用微生物菌种,已被广泛用作发酵剂[1],在许多发酵食品中起重要作用。植物乳杆菌除了在发酵过程中能产生各种代谢产物影响发酵食品的香气、风味、颜色和质地等[2-4],还可以产生诸如有机酸、双乙酰、过氧化氢、二氧化碳、脂肪酸、乙醇和细菌素等抗菌物质,有效抑制食品腐败和病原微生物的生长[5-6]。植物乳杆菌还具有维持肠道内菌群平衡、预防各种肠道疾病和改善免疫功能等益生特性[7],对人体健康具有积极作用。

本研究团队前期较为系统地研究了植物乳杆菌KLDS 1.0391产细菌素特性[8],该菌还具有一定的益生特性,能够在一些食品中作为生防菌种使用[9]。生防菌种制备的第一个关键环节就是高密度发酵,为了获得高浓度植物乳杆菌菌体密度,有必要优化其工业化发酵生产用培养基。

理想的高密度发酵培养基应有如下特点:使菌体在较短时间内获得较高的浓度;发酵液中的微生物与培养基分离较容易;缓冲能力较好;培养基成分价格较低且易得。天然食物基质由于营养物质丰富,是培养基的首选,尤其是生产某些食品时产生的废弃物,用其做培养基既可满足微生物生产需求,又解决了废弃物污染环境的问题。常用的用作培养基的物质包括:麦芽汁、果蔬汁、玉米浆以及蛋白水解物等。Rivas等[10]以玉米浆等为原料,开发了一种廉价的鼠李糖乳杆菌发酵培养基;Li等[11]以麦麸为培养基氮源,降低了菊糖芽孢乳杆菌发酵生产乳酸的成本;Sato等[12]发现大豆分离蛋白、牛乳清蛋白和蛋清蛋白水解物有促进嗜酸乳杆菌和双歧杆菌增殖的作用。上述研究表明脱脂乳粉、乳清、麦麸、玉米浆粉等天然物质有潜力用于高密度发酵植物乳杆菌。

本研究的主要目的是以植物乳杆菌KLDS 1.0391为对象,优化可用于其高密度发酵的价格低廉的天然培养基,研究植物乳杆菌直投式菌种对酸奶品质的影响,以期获得具有益生作用的酸奶辅助发酵剂。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

植物乳杆菌KLDS 1.0391 乳品科学教育部重点实验室(东北农业大学);枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)ATCC6633 中国药品生物制品检定所;植物乳杆菌P83 法国普尔斯有限公司;中性蛋白酶(100000 U/g) 北京索来宝科技有限公司;乳清粉 芬兰维利奥公司有限公司;玉米浆粉 山东省济宁市双华工贸有限公司;麦麸 山东省菏泽市黄河滩农户人家;脱脂乳粉 南京益生源生物科技有限公司;酸奶发酵剂 法国普尔斯有限公司;牛奶 市售;MRS培养基:蛋白胨5.0 g,牛肉膏5.0 g,胰蛋白胨10.0 g,酵母粉5.0 g,Tween-80 1.0 g,葡萄糖20.0 g,硫酸锰0.25 g,乙酸钠5.0 g,柠檬酸氢二铵2.0 g,硫酸镁0.58 g,磷酸氢二钾2.0 g,蒸馏水1 L;营养肉汤培养基:蛋白胨10.0 g,牛肉膏5.0 g,NaCl 5.0 g,蒸馏水1 L;其它药品均为分析纯或者生化纯。

KRH-3000发酵罐 江苏科海生物工程设备有限公司;BCN1360型生物洁净工作台 上海佳胜实验设备有限公司;SPX-150B生化培养箱 上海智城分析仪器制造有限公司;GL-21M高速冷冻离心机 上海市离心机械研究所;LGJ-1冷冻干燥机 上海医用分析仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株的活化与培养 将-80 ℃冰箱中冷冻保存的植物乳杆菌KLDS 1.0391和枯草芽孢杆菌ATCC 6633,以2%接种量分别接种于MRS培养基和营养肉汤培养基中,于37 ℃培养16 h,连续活化传代3次备用。

1.2.2 10 L发酵罐的发酵工艺 在前期实验的基础上,优化出10 L发酵罐的发酵工艺如下,装罐量6 L,按照3%接菌量分别接种植物乳杆菌KLDS 1.0391,发酵温度37 ℃,发酵pH6.0,脱脂乳粉、乳清粉、麦麸及玉米浆粉培养基的发酵时间分别为20、40、24、11 h。

1.2.3 脱脂乳、乳清和麦麸酶水解物的制备 参照文献方法[13]分别将脱脂乳粉、乳清粉和麦麸配制成4%(w/v)的溶液,调节pH至7.0,添加中性蛋白酶,于40 ℃恒温水解,水解过程中通过加入氢氧化钠溶液使pH恒定在7.0。根据pH-stat法[14]分别检测脱脂乳、乳清和麦麸溶液的水解度,至水解度达到0%、5%、10%、15%、20%、25%,添加2%葡萄糖和0.1% Tween-80,制备成不同水解度的脱脂乳、乳清和麦麸培养基。

1.2.4 脱脂乳、乳清和麦麸培养基的高密度发酵 上述0%、5%、10%、15%、20%、25%水解度的脱脂乳、乳清和麦麸培养基,分别接种3%的植物乳杆菌KLDS 1.0391培养液,采用10 L发酵罐发酵,发酵时间分别为20、40、24 h,发酵结束后取发酵液,测定植物乳杆菌的活菌数量和抑菌效果。

1.2.5 最佳高密度发酵培养基的确定 参照文献[13]将玉米浆粉配制成4%(w/v)的溶液,添加2%葡萄糖(补充碳源)和0.1% Tween-80(具有促进细菌素合成的作用),制备成玉米浆粉培养基。分别以15%水解度的脱脂乳培养基、15%水解度的乳清培养基、20%水解度的麦麸培养基以及上述玉米浆粉培养基作为发酵培养基,采用1.2.2的工艺参数发酵植物乳杆菌KLDS 1.0391,以活菌数和抑菌效果为指标筛选植物乳杆菌KLDS 1.0391的最佳高密度发酵培养基。

1.2.6 植物乳杆菌直投式菌种的制备 植物乳杆菌KLDS 1.0391以玉米浆粉为培养基时,参照文献方法[15]得到最佳发酵工艺参数为:发酵温度34.7 ℃,发酵恒pH6.2,接种量3.1%;冻干保护剂为:11.3%的脱脂乳,9.8%的蔗糖,5.1%的谷氨酸钠,0.2%的Tween-80;预冻条件为:初始菌浓度1011CFU/mL、预冻温度-80 ℃、预冻时间8 h,采用上述参数制备出冻干形式的植物乳杆菌直投式菌种的活菌数为11.29 lg CFU/g。

表1 试验组别Table 1 Test group

表2 酸奶样品感官评价评分标准和评分指标Table 2 Sensory description and evaluation indexes for the yogurt

1.2.7 酸奶的制作工艺 将牛奶预热至65 ℃,加入6.5%蔗糖混匀,然后于95 ℃灭菌5 min,待冷却至42 ℃时按表1的试验组别接种酸奶发酵剂、植物乳杆菌P83和植物乳杆菌KLDS 1.0391,接种完成后于43 ℃发酵(以pH4.6为发酵终点),发酵结束后于4 ℃后熟24 h制成成品酸奶。

1.2.8 指标的测定

1.2.8.1 活菌数量的测定 采用平板菌落计数法[16]测定活菌数量,取1 mL发酵液用9 mL无菌生理盐水稀释至合适倍数后,涂布于MRS琼脂培养基,37 ℃培养48 h后计数。

1.2.8.2 抑菌活性的测定 参照文献方法[17],取10 mL发酵液经12000 r/min离心15 min,收集无细胞发酵上清液,采用双层平板打孔法测定抑菌活性,具体操作如下:按每平皿10 mL将1.2%的琼脂倾倒于无菌平皿中晾干;以0.6%的接种量将枯草芽孢杆菌接入含0.7%琼脂的营养肉汤培养基中,倾倒6 mL含有枯草芽孢杆菌的营养肉汤琼脂培养基于底层琼脂上;晾干后用打孔器打孔,向孔中加入100 μL无细胞发酵上清液,在生物洁净工作台中扩散3 h后,置于适宜条件下培养后用游标卡尺测定抑菌圈直径。

1.2.8.3 发酵终点的测定 当样品的pH达到4.6时,即可停止发酵,测定1.2.6表1中四个试验组到达发酵终点的时间。

1.2.8.4 pH和滴定酸度的测定 将酸奶分别置于4 ℃储藏14 d和25 ℃储藏7 d,参照文献方法[9]测定pH和滴定酸度。

1.2.8.5 黏度的测定 将酸奶分别置于4 ℃储藏14 d和25 ℃储藏7 d,采用Brookfiled DV-Ⅱ+Pro黏度计测定酸奶的黏度。

1.2.8.6 感官评价 选择3名男性和9名女性共12人,年龄在22～32岁,进行感官评价,分别从质地、香气、流动性、色泽、口感和风味六个方面进行评价。评分标准如表2所示。

1.3 数据处理

所有试验均独立重复三次,采用SPSS 20.0进行数据处理及显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同水解度的脱脂乳培养基对植物乳杆菌生长和细菌素合成的影响

脱脂乳培养基的水解度对植物乳杆菌KLDS 1.0391的生长和产细菌素能力影响显著(见图1);当水解度为0%～15%时,活菌数和抑菌圈直径均随水解度提高呈上升趋势;之后随水解度提高呈下降趋势;当水解度为15%时,活菌数最大,达到9.39 lg CFU/mL,抑菌圈直径也最大,达到12.28 mm,确定脱脂乳培养基的最佳水解度为15%。

图1 不同水解度的脱脂乳培养基对植物乳杆菌生长和细菌素合成的影响Fig.1 Effect of medium with different hydrolysis degrees ofskimmed milk on growth and bacteriocin synthesis ofLactobacillus plantarum KLDS 1.0391

2.2 不同水解度的乳清培养基对植物乳杆菌生长和细菌素合成的影响

当乳清培养基的水解度为0～15%时,植物乳杆菌KLDS 1.0391的活菌数和抑菌圈直径随水解度提高呈上升趋势,之后随水解度增加开始呈下降趋势;当水解度为15%时,活菌数量达最大值(9.01 lg CFU/mL),抑菌圈直径达12.66 mm,也为最大值(见图2)。确定乳清培养基的最佳水解度为15%。

图2 不同水解度的乳清培养基对植物乳杆菌生长和细菌素合成的影响Fig.2 Effect of medium with different hydrolysis degrees ofwhey on growth and bacteriocin synthesis ofLactobacillus plantarum KLDS 1.0391

2.3 不同水解度的麦麸培养基对植物乳杆菌生长和细菌素合成的影响

麦麸培养基的水解度显著影响植物乳杆菌KLDS 1.0391的生长和产细菌素能力(见图3),当麦麸培养基的水解度为0%～20%时,植物乳杆菌KLDS 1.0391的活菌数和抑菌圈直径随水解度提高呈逐渐上升趋势,之后随水解度提高开始呈下降趋势;当水解度为20%时,活菌数最大,达到9.41 lg CFU/mL,抑菌圈直径也最大,达到12.09 mm。确定麦麸培养基的最佳水解度为20%。

图3 不同水解度的麦麸培养基对植物乳杆菌生长和细菌素合成的影响Fig.3 Effect of medium with different hydrolysis degrees ofwheat bran on growth and bacteriocin synthesis ofLactobacillus plantarum KLDS 1.0391

2.4 比较四种培养基对菌株生长及细菌素合成的影响

由图4可知,植物乳杆菌KLDS 1.0391在最佳水解度的脱脂乳、乳清、麦麸及玉米浆粉四种培养基中发酵结束时,所获得的活菌数由大到小依次为:玉米浆粉培养基>20%水解度的麦麸培养基>15%水解度的脱脂乳培养基>15%水解度的乳清培养基;所获得的抑菌效果由大到小依次为:玉米浆粉培养基>15%水解度的乳清培养基>15%水解度的脱脂乳培养基>20%水解度的麦麸培养基;植物乳杆菌KLDS 1.0391在玉米浆粉培养基发酵结束时,活菌数达到最大值(9.53 lg CFU/mL),相比15%水解度的乳清培养基活菌数提高了5.7%;抑菌圈直径也达到最大值(12.69 mm),相比20%水解度的麦麸培养基抑菌活性提高了5.2%。上述结果说明植物乳杆菌KLDS 1.0391在玉米浆粉培养基中菌体生成量和细菌素合成量最佳,玉米浆粉培养基(成分为4%玉米浆粉、2%葡萄糖和0.1% Tween-80)可以作为其高密度发酵廉价培养基。

图4 四种培养基对植物乳杆菌生长和细菌素合成的影响Fig.4 Effect of four different mediumson growth and bacteriocin synthesis ofLactobacillus plantarum KLDS 1.0391

2.5 植物乳杆菌直投式发酵剂在酸奶中的应用

2.5.1 植物乳杆菌直投式菌种对酸奶发酵时间、pH和滴定酸度的影响 所有样品均在4.5～6 h到达发酵终点(见图5),由于添加植物乳杆菌P83,阳性对照组发酵时间较空白对照组延长,且本实验所制备的菌种的发酵时间相比阳性对照组也延长,但这种影响在所有的组别中无显著性差异(P>0.05)。

图5 四组试验达到发酵终点所用的时间Fig.5 The time for four groups of experimentsto reach the end of fermentation

由图6可知,酸奶在4 ℃贮藏时,阳性对照组pH下降最为缓慢,其次是试验组2、试验组1,而空白对照组的pH下降最为迅速。当贮藏温度为25 ℃时,四组试验的pH仍然保持了4 ℃时的变化趋势,但pH比4 ℃时低。上述结果说明在4 ℃冷藏条件下,由于植物乳杆菌KLDS 1.0391直投式菌种的添加,在一定程度上减缓了酸奶后酸化程度,在25 ℃下,这种作用效果则不明显(P>0.05)。

图6 直投式菌种对酸奶储藏过程中pH的影响Fig.6 Effect of direct-in-vat strainson pH of yogurt during storage

由图7可知,酸奶在4 ℃贮藏时,空白对照组酸度上升最高,其次是阳性对照组,而添加植物乳杆菌制备的酸奶滴定酸度上升的最小。在25 ℃贮藏时,阳性对照组滴定酸度上升的最小,空白对照组和本实验菌株制备的实验组滴定酸度差异不显著(P>0.05)。上述结果说明在4 ℃冷藏条件下,植物乳杆菌KLDS 1.0391直投式菌种对酸奶滴定酸度的升高有较好的抑制作用,在25 ℃下,则对酸奶滴定酸度的升高无明显的抑制作用(P>0.05)。

图7 直投式菌种对酸奶储藏过程中滴定酸度的影响Fig.7 Effect of direct-in-vat strainson titratable acidity of yogurt during storage

2.5.2 植物乳杆菌直投式菌种对酸奶黏度的影响 酸奶在4 ℃和25 ℃贮藏时,空白对照组的粘度高于其它组,其次是阳性对照组和本研究制备的直投式菌种组(见图8),上述结果说明由于添加植物乳杆菌,导致酸奶粘度下降。

图8 直投式菌种对酸奶储藏过程中黏度的影响Fig.8 Effect of direct-in-vat strainson viscosity of yogurt during storage

2.5.3 植物乳杆菌直投式菌种对酸奶感官评价的影响 从质地、香气、流动性、色泽、口感和风味六个方面对4 ℃贮藏的酸奶进行感官评价(见表3)。储藏时间为0、1、2、5、8 d时,试验组1、试验组2与对照组差异不显著(P>0.05),说明加入植物乳杆菌没有对酸奶的感官评价产生很大的影响。

3 讨论与结论

本研究用不同水解度的脱脂乳、乳清、麦麸和玉米浆粉制备植物乳杆菌KLDS 1.0391高密度发酵培养基,最终从中筛选出比酵母粉、蛋白胨等价格更为低廉的玉米浆粉为培养基,成分为4%玉米浆粉、2%葡萄糖和0.1% Tween-80。采用上述玉米浆粉培养基发酵植物乳杆菌KLDS 1.0391,活菌数达到9.53 lg CFU/mL,抑菌圈直径达到12.69 mm,优于已报道[18]的采用MRS培养基发酵植物乳杆菌KLDS 1.0391获得的水平(活菌数达9.21 lg CFU/mL,抑菌圈直径达11.41 mm)。目前针对植物乳杆菌的发酵培养基成分普遍比较复杂,获得的活菌数差异较大,白玉柱等[19]以玉米浆粉为氮源优化MRS培养基组成成分,最终使植物乳杆菌HEW-A401活菌数达到8.77 lg CFU/mL。而刘香英等[20]优化了植物乳杆菌K25高密度发酵培养基,活菌数可达10.71 lg CFU/mL。本研究优化获得的培养基,可使植物乳杆菌KLDS 1.0391活菌数达9.53 lg CFU/mL,还具有价格低廉、处理方便的优势,作为工业化发酵生产用培养基有极大的可行性。

表3 4 ℃储藏过程中酸奶感官评价Table 3 The results of sensory evaluation of yogurt during storage at 4 ℃

注:同行数据字母相同表示差异不显著(P>0.05)。具有良好的耐酸耐胆盐特性,并且在细胞黏附、降胆固醇、免疫活性等方面表现出一定的益生特性[21],本实验将植物乳杆菌KLDS 1.0391作为益生辅助发酵剂应用于酸奶,不仅可以缓解酸奶后酸化程度,也可以提高酸奶的营养价值和益生作用,因此本实验得到的植物乳杆菌直投式菌种作为具有益生作用的酸奶辅助发酵剂具有一定的潜力。