不同解冻方式对鲢鱼肌球蛋白结构和性质的影响

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(1.大连海洋大学食品科学与工程学院,辽宁大连 116023;2.中国水产科学研究院南海水产研究所,农业部水产品加工重点实验室,广东广州 510300)

我国淡水养殖业发达,鲢鱼养殖成本低、生长快,资源丰富,近年来成为一种极具开发潜力的水产品,是我国重要的淡水经济鱼。传统的白姑鱼、红娘鱼、蛇鲻鱼、铜盆鱼等高等级海水鱼糜原料逐年减少,鱼糜企业为了满足国内市场日益增长的需求,开始收购竹荚鱼等红肉类原料鱼来掺杂生产鱼糜,或者在高等级的鱼糜原料中掺入一定比例的低劣原料鱼来降低产品成本,因此淡水鱼糜受到关注,而且在近几年快速发展。

鱼糜生产首先从去骨鱼肉中去除血液、脂质、肌浆蛋白和其它杂质肌原纤维蛋白的浓缩物[1],鱼糜主要由盐溶性蛋白组成,肌球蛋白是肌原纤维蛋白中凝胶形成的关键组分。解冻是冷冻鱼糜进一步加工成鱼糜制品前最重要的一步,是一个复杂的热量转移过程,会发生一系列的物理和化学变化[2]。解冻时,细胞只能吸收融化一部分水,而另一部分水会渗透到细胞外造成汁液流失,汁液流失会影响细胞的微观结构,造成鱼肉感官品质的下降等,因此解冻方式的选择至关重要。

目前有许多解冻方法,较传统且应用广泛的两种解冻方式是冷水解冻和空气解冻[3],工厂生产效率低,解冻过程中会出现微生物大量繁殖、蛋白质氧化[4-5]等现象,快速解冻方式是目前行业迫切需要的。为了提高生产效率和保证品质,微波解冻作为一种新型解冻技术,将冷冻品利用微波的穿透性迅速加热,使其内外同步解冻并升温至不滴水的状态[6],因为其解冻时间短的优势备受青睐。据Karel等[7]报道,微波解冻有速度快、均匀度高且对肌肉组织损伤少等优点。Taher等[8]以冻结牛肉为研究对象,通过开发微波解冻模型,发现微波解冻时间是常规解冻时间的1/5。田晨曦等[9]研究了不同解冻方式(自然解冻、静水解冻、微波解冻和超声解冻)对南美白对虾品质的影响也发现微波解冻时间较短。常海军等[10]以猪肉为研究对象发现微波解冻有利于保持肉的嫩度和色泽,其肌肉全蛋白含量较高,全质构特性较好。Fik等[11]将面包进行微波解冻和空气解冻,发现微波解冻下的面包质量更好。

目前,解冻方式对冷冻鲢鱼肌球蛋白影响的报道较少,因此,本研究通过比较传统方法(冷水解冻,cold water thawing,WT)、微波方法(微波解冻,microwave thawing,MT)、联合方法(微波-冷水联合解冻,microwave-cold water joint thawing,MWT)对鲢鱼肌球蛋白的结构和性质(巯基含量、表面疏水性、溶解度、色氨酸荧光光谱、傅里叶红外转换光谱、热稳定性)的影响,为冷冻鱼糜微波解冻品质控制提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鲜活白鲢鱼 大连熟食品交易中心;三磷酸腺苷(ATP) 化学纯,美国Sigma药品公司;溴化钾 光谱纯,天津市大茂化学试剂厂;三(羟甲基)氨基甲烷(Tris) 生化试剂,国药集团化学试剂有限公司;其余试剂均为国产分析纯。

HR/T20MM立式高速冷冻离心机 湖南赫西仪器装备有限公司;NEXUS670型红外光谱仪 美国PerkinElmer公司;Q20差示扫描量热仪 美国Hitachi High-tech science公司;SynergyH1/H1M酶标仪 美国伯腾仪器有限公司;F-2700荧光分光光度计 日本Hitachi公司;DS-1高速组织捣碎机 上海标本模型厂制造;G80D23CSL-Q6格兰仕微波炉 佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司;SL-1050D4海尔商用立式四门冷冻厨房冰箱 青岛海尔特种电冰柜有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液配制 试剂A:0.1 mol/L氯化钾以及0.02 mol/L三羟甲基氨基甲烷,搅拌溶解,0.1 mol/L盐酸调pH至7.0后定容至1 L于4 ℃环境中备用;试剂B:0.45 mol/L氯化钠26.298 g,0.2 mol/L醋酸镁,0.001 mol/L EDTA,0.02 mol/L三羟基甲基氨基甲烷,0.005 mol/Lβ-疏基乙醇,搅拌溶解,用0.1 mol/L盐酸调pH至6.8,用蒸馏水定容至1 L,放置于4 ℃环境中备用;试剂C:0.5 mol/L氯化钾,0.02 mol/L三羟甲基氨基甲烷,0.005 mol/Lβ-疏基乙醇,搅拌溶解0.1 mol/L盐酸调pH至7.5,蒸馏水定容至1 L,放置于4 ℃环境中备用;试剂D:0.001 mol/L KHCO3溶液;试剂E:0.5 mol/L氯化钾,0.02 mol/L三羟甲基氨基甲烷,搅拌溶解,0.1 mol/L的盐酸调pH至7.0后定容至1 L,放置于4 ℃环境中备用。

1.2.2 肌球蛋白的提取 根据Cao等[12]的提取方法,略作修改。将白鲢鱼宰杀,去头去内脏,用4 ℃去离子水将其冲洗干净,手工剔取白鲢鱼白肉,切成肉糜状,加入10倍体积的溶液A于4 ℃下漂洗10 min,3000 r/min均质后,在3000 r/min下离心5 min,取沉淀;沉淀于5倍体积溶液B中悬浮,并加ATP至终浓度为0.005 mol/L,于4 ℃下放置2 h;8000 r/min离心20 min,上清液加入3倍体积溶液D于4 ℃下放置15 min;9000 r/min离心15 min取沉淀;沉淀加入2.5倍体积的溶液C悬浮,于4 ℃下放置10 min后加入2.5倍体积的溶液D稀释,并加MgCl2至终浓度为0.01 mol/L,于4 ℃下放置过夜;10000 r/min离心15 min,沉淀用1倍体积溶液E溶解,5000 r/min离心10 min,取上清,透析一夜,2 h更换一次去离子水,所得即为肌球蛋白。

1.2.2 肌球蛋白浓度的测定 采用双缩脲法[13],使用SynergyH1/H1M酶标仪在540 nm下测定吸光值,以BSA的质量浓度为横坐标,吸光值为纵坐标绘图。准确吸取1 mL提取的鲢鱼肌球蛋白溶液,加入4 mL双缩脲试剂并混合均匀,将所有样品避光静置30 min,测量其在540 nm处的吸光值,按照标准曲线求出相应的肌球蛋白浓度。

1.2.3 肌球蛋白的不同解冻处理 分装稀释成5 mg/mL的样品于自封袋内进行密封。将样品冻结在(-20±1) ℃条件下,24 h后进行解冻。冷水解冻:样品放入盛有水的烧杯中,远离热源解冻,水温(18±2) ℃,中心温度达4 ℃后解冻完成;微波解冻:微波输出功率为800 W,频率为2450 MHz,设备按质量设置解冻时间,中心温度达4 ℃后解冻完成;微波-冷水联合解冻:样品浸入盛有水的容器中,再微波解冻。样品解冻后进行巯基含量、表面疏水性、溶解度、色氨酸荧光光谱、傅里叶红外转换光谱及热稳定性的测定。

1.2.4 巯基含量 根据Ellman等[14]的研究方法,略作修改。吸取0.5 mL 1 mg/mL肌球蛋白溶液加入2 mL 0.2 mol/L Tris-HCl缓冲液(内含0.08 mmol/L尿素,2% SDS,10 mmol/L EDTA,pH7.5),再加入100 μL DTNB(10 mmol/L DTNB,pH7.2),混匀后40 ℃水浴25 min。空白为0.5 mol/L KCl的20 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)缓冲液,使用SynergyH1/H1M酶标仪在412 nm下测定吸光值。按下列公式计算巯基含量:

其中:A412为肌球蛋白溶液吸光值-空白对照组吸光值;C为分子吸光系数,值为13600 M/cm。

1.2.5 表面疏水性 根据Benjakus等[15]的研究方法,略作修改。将鲢鱼肌球蛋白用含0.5 mol/L KCl的20 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)缓冲液稀释成0.1～0.5 mg/mL的系列浓度,然后取各浓度蛋白溶液2 mL加入10 μL ANS(10 mmol/L ANS,20 mmol/L Tris-HCl,pH7.5),混匀避光静置10 min。使用SynergyH1/H1M酶标仪设置参数:激发波长303 nm,发射波长485 nm,增益50。以荧光强度对鲢鱼肌球蛋白各浓度作图,所得直线斜率即为肌球蛋白表面疏水性系数。

1.2.6 溶解度 根据周建中等[16]的研究方法,略作修改。将鲢鱼肌球蛋白用含0.5 mol/L KCl的20 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)缓冲液稀释成3 mg/mL,4 ℃下静置30 min,之后4 ℃下10000 r/min离心10 min,收集上清液,采用双缩脲法测上清蛋白含量。按下列公式计算溶解度:

1.2.7 色氨酸荧光光谱 根据Li等[17]的研究方法,略作修改。将肌球蛋白样品用含0.5 mol/L KCl的20 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)缓冲液稀释成1 mg/mL。使用Hitachi荧光分光光度计进行测定,设定激发光的起始波长300 nm,荧光发射波长280 nm,激发光的终止波长450 nm,该条件下荧光强度值为荧光图谱中的峰值。

1.2.8 傅里叶红外转换光谱(FT-IR) 根据Liu[18]的研究方法,略作修改。样品冷冻干燥后用玛瑙研钵研成粉末,取2 mg肌球蛋白粉末与烘干后的无水溴化钾100 mg充分混合,在约15 MPa的压力下加压2 min形成溴化钾压片,光谱观察范围为450～4000 cm-1。

1.2.9 热稳定性分析(DSC) 根据Dergez[19]的研究方法,略作修改。准确称量(10±2) mg样品置于铝盘中并立即密封。以空盘作为空白,扫描温度为0～150 ℃,升温速率为5 ℃/min。通过扫描出的峰值确定变性温度(Td, ℃)和计算峰面积得到热焓值(ΔH,J·g-1)。

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel 2010软件处理数据,指标测定为3次平行测定结果。采用Microsoft Excel 2010软件绘图,利用IBM SPSS Statistics 21.0统计分析软件进行Duncan法多重比较及显著性分析。

2 结果与分析

2.1 肌球蛋白浓度

获得标准曲线回归方程为:Y=0.025x-0.0006(R2=0.9999)其中:Y为吸光度的平均值,X为肌球蛋白浓度。经过计算所提取出的肌球蛋白浓度为25.84 mg/mL。

图1 肌球蛋白浓度的标准曲线Fig.1 The standard curve of myosin content

2.2 解冻方式对肌球蛋白巯基含量的影响

巯基对发挥蛋白质的功能特性有很大的作用,解冻后冰晶融化重新被吸收的过程中肌原纤维蛋白的构象发生了变化,导致巯基暴露,进而被氧化成二硫键,导致巯基含量降低[20-21]。从图2中可以看出,不同解冻方式下巯基含量无显著性差异(P>0.05),但MT方式下的肌球蛋白巯基含量相对较高,为23.74 nmol/mg,意味着与其它两种方式处理下的肌球蛋白相比二硫键更少,说明肌球蛋白构象变化相对较小,氧化程度低于其它两种解冻方式,可能是解冻过程中MT方式下解冻时间相对较短,巯基氧化成二硫键数量少,而MWT方式下由于需要加热水进而解冻肌球蛋白因而时间较长,冰晶融化后重新被吸收的过程中肌球蛋白构象发生变化,巯基氧化成二硫键。宦海珍等[22]通过探究微波解冻对冻结秘鲁鱿鱼蛋白质氧化程度的影响发现低功率的微波解冻可降低秘鲁鱿鱼肌肉的蛋白质氧化程度,巯基含量随着微波功率的增加逐渐降低。同时Kim[23]也发现微波解冻可以降低蛋白质的变性程度,与研究结果一致,微波解冻对肌球蛋白影响较小,蛋白质氧化程度低。

图2 不同解冻方式下鲢鱼肌球蛋白巯基含量Fig.2 Changes in sulfhydryl content of thesilver carp myosin at different thawing methods注:不同小写字母表示不同解冻方式处理下差异显著(P<0.05)。

2.3 解冻方式对肌球蛋白表面疏水性的影响

蛋白质的变性程度和分子结构的变化可以通过外源疏水探针结合的蛋白质分子表面疏水性氨基酸相对含量来衡量,即蛋白质分子的展开及非极性氨基酸的暴露情况[24-25]。表面疏水性越高,蛋白质变性程度越大[26]。从图3中可以看出,MT方式下的表面疏水性的相对含量为530,与WT方式下的有显著性差异(P<0.05),MT方式下的肌球蛋白较WT方式下表面疏水性显著下降,说明肌球蛋白在WT方式下氧化导致肌球蛋白蛋白结构展开,聚集严重,暴露出的疏水性氨基酸残基更多使得蛋白表面疏水性增强,此时肌球蛋白球状构象变化较大,而MT方式下变性程度最小,肌球蛋白构象保持最好,与巯基含量结果一致。MWT方式下的表面疏水性的相对含量与WT和MT方式下的均为无显著性差异(P>0.05)。该实验结果说明微波解冻可降低蛋白质的变性程度。

图3 不同解冻方式下鲢鱼肌球蛋白表面疏水性Fig.3 Changes in surface hydrophobicity ofthe silver carp myosin at different thawing methods注:不同小写字母表示不同解冻方式处理下差异显著(P<0.05)。

2.4 解冻方式对肌球蛋白溶解度的影响

蛋白质溶解度的大小在实际应用中非常重要。从图4中可以看出三种解冻方式处理下的鲢鱼肌球蛋白溶解度无显著性差异(P>0.05),溶解度越低说明蛋白聚集程度高,伴随严重的变性现象。解冻后溶解度WT方式下最高,为79.68%,其次是MT方式,MWT方式下最低,与巯基含量和表面疏水性的结果不一致,可能是WT方式下氧化虽然使巯基基团氧化成二硫键,但肌球蛋白聚集程度不大,未对溶解度造成很大影响。

图4 不同解冻方式下鲢鱼肌球溶解度Fig.4 Changes in solubility of the silver carpmyosin at different thawing methods注:不同小写字母表示不同解冻方式处理下差异显著(P<0.05)。

2.5 解冻方式对肌球蛋白色氨酸荧光强度的影响

色氨酸内源荧光对环境非常敏感,因此可用来检测蛋白质的构象和微环境的极性变化[27]。蛋白质三级结构的变化可以通过色氨酸残基的暴露程度反映。从图5中可以看出,不同解冻方式对色氨酸荧光光谱形状影响不显著,即肌球蛋白构象变化不明显,但对荧光强度影响显著,荧光强度下降的趋势为:WT≥MWT>MT,WT与MWT荧光强度基本一致,解冻过程中色氨酸的微环境发生变化,蛋白展开变性使得埋藏在肌球蛋白分子内部色氨酸的吲哚基团暴露在表面,说明MT方式下肌球蛋白三级结构展开严重,肌球蛋白的天然排列方式较其它方式破坏严重,色氨酸残基暴露多。研究发现随着加热温度的升高,内源荧光强度逐渐降低[28],因此,分析原因可能是MT方式解冻过程中受热引起肌球蛋白三级结构展开,进一步研究及中试试验过程中应寻求精准控温的微波解冻设备。

图5 不同解冻方式下鲢鱼肌球蛋白色氨酸荧光强度Fig.5 Changes in fluorescence spectra ofthe silver carp myosin at different thawing methods

2.6 解冻方式对肌球蛋白傅里叶红外转换光谱的影响

傅里叶红外转换光谱能够用来表征蛋白质结构,尤其在测定蛋白质二级结构中发挥重要作用,利用与分子中有振动模式的化学键能够研究分子的结构从而得到与蛋白质二级结构相关的信息。酰胺I带(1600～1700 cm-1)的红外吸收峰主要由C=O的伸缩振动引起的,用此来研究其二级结构的变化,其中1600～1639 cm-1被认为是β-折叠波段[29],从图6中可以看出在1600 cm-1处有一个大的吸收峰,这是蛋白质的β-折叠区域。对比三种不同解冻方式,MWT方式下的β-折叠含量最低,说明红外吸收强,肌球蛋白变性程度高于MT方式和WT方式,MT方式下β-折叠含量最高,肌球蛋白变性程度最低,MWT方式下的红外吸收最强,肌球蛋白变性程度最大。

图6 不同解冻方式下鲢鱼肌球蛋白FT-IR图Fig.6 Changes in FT-IR spectra of thesilver carp myosin at different thawing methods注:(a)MT;(b)WT;(c)MWT。

2.7 解冻方式对肌球蛋白热稳定性的影响

DSC可直接表征蛋白质结构稳定性,曲线中有吸收峰出现表明蛋白变性有热量被吸收。热焓值的大小反映蛋白质的变性程度,变性温度、热焓值与蛋白质变性程度呈负相关,转变温度与变性焓越高,蛋白质的热稳定性越高、变性程度越小[30]。从表1中可以看出,转变温度为MWT>MT>WT,说明肌球蛋白的最大吸热转变温度受解冻方式的影响。解冻后的肌球蛋白变性转变温度均高于45 ℃,与其它研究结果不一致,Ogawa等[31]利用DSC研究了10种鱼类的肌球蛋白变性转变温度发现各种鱼的肌球蛋白最大吸热转变发生在45 ℃左右,分析原因可能是进行测试的肌球蛋白样品浓度过低,为5 mg/mL。WT方式下肌球蛋白变性的转变温度最低,而MWT方式下的肌球蛋白转变温度最高,说明WT方式下肌球蛋白热稳定性低,变性越大,抗变性能力越弱,MT方式下肌球蛋白热稳定性相对较好。在不同解冻方式处理下的肌球蛋白发生复杂变化,三种解冻方式下的肌球蛋白热力学特性差异较大。

表1 不同解冻方式对肌球蛋白热稳定性的影响Table 1 Changes in the thermal stability of thesilver carp myosin at different thawing methods

3 结论

不同的解冻方式对鲢鱼肌球蛋白解冻后的结构和性质有不同的影响。就巯基含量、表面疏水性和傅里叶红外转换光谱和热稳定性变化指标看,微波解冻较优于其它两种方式;就溶解度、色氨酸荧光强度变化而言,冷水解冻优于其它两种方式。三种解冻方式中微波解冻对鲢鱼肌球蛋白的结构和性质影响相对较小,比较适合鲢鱼的解冻。未考察微波解冻功率和解冻时间对肌球蛋白解冻的影响,需进一步从分子层面研究解冻方式对鲢鱼肌球蛋白的作用机制,并考察肌球蛋白氧化的影响。