基于线粒体凋亡信号通路的二甲双胍抗骨肉瘤体内外作用机制研究*

王延国 宫庆娜 杨延霞 王 军 周忠水

山东省滨州市中心医院 1 骨外科 2 麻醉科，山东省惠民县 251700

骨肉瘤(Osteosarcoma),又称成骨肉瘤,是临床常见原发恶性骨肿瘤，占原发性恶性骨肿瘤首位(40.51%)，18岁以下的青少年为好发人群,严重影响青少年的身体健康[1-2]。二甲双胍作为一种经典的降糖药物，其抗肿瘤作用近年来受到广泛重视[3-4]。本研究项目以人骨肉瘤裸鼠模型及细胞株U2OS、143B细胞为研究对象，分析二甲双胍在体内和体外对人骨肉瘤细胞生长增殖的影响并初步探讨其分子机制，为其作为抗骨肉瘤药物研发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 人骨肉瘤U2OS、143B细胞株购自中国科学院北京生命科学院细胞所。细胞培养用胎牛血清、双抗及DMEM培养基购自Hyclone公司。二甲双胍、MTT、Hoechst33342购自上海碧云天生物公司。PI单染试剂盒购自南京凯基生物。细胞培养CO2孵箱为赛默飞世尔(Thermo Fisher公司)仪器。流式细胞计数仪为Moflo XDP贝克曼库尔特(Beckman Coulter公司)。

1.2 细胞培养 细胞培养于含双抗及10%胎牛血清RPMI1640培养基，细胞孵育条件为37℃，5%CO2的湿润无菌环境，每2d更换新的培养基。

1.3 二甲双胍对骨肉瘤细胞生长增殖的影响(MTT法) 骨肉瘤细胞株细胞接种于96孔培养板，每组设5个复孔。二甲双胍分别作用24、48、72h后，每孔加入浓度为5g/L的MTT溶液10μl，再继续培养4h。小心吸取孔内培养液，每孔加150μl DMSO，避光轻微震荡5min使结晶充分溶解，酶联免疫检测仪测定吸光度(A)值，检测波长580nm，以630nm波长来校正数值。细胞存活抑制率=(对照组吸光度数值-二甲双胍组吸光度数值)/对照组吸光度×100%。

1.4 细胞凋亡的形态学观察(Hoechst33342染色) 把对数生长繁殖期骨肉瘤细胞接种于盖玻片，细胞贴壁后，每孔放入二甲双胍；对照组放入等量磷酸盐缓冲液(PBS)。作用48h后，弃去药物，PBS液漂洗2次，细胞固定液固定约30min；吸掉固定液，PBS漂洗2次，加入推荐浓度的Hoechst33342暗室避光反应25min；显微镜下观察两组细胞形态并拍照记录。

1.5 流式细胞术测定细胞周期时相 将骨肉瘤细胞均匀种植于六孔板上，细胞贴壁后，加入二甲双胍干预48h，以无EDTA的胰酶消化骨肉瘤细胞并分别收集；PBS漂洗2次，离心弃掉上清液；收集大约105/组细胞加入缓冲液1ml并重悬细胞；继而加入5μl Annexin V-FITC凋亡检测试剂及5μl PI试剂，避光反应15min，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.6 Western Blot法检测对细胞周期凋亡蛋白的影响 收集不同浓度组处理48h后的骨肉瘤细胞，使用细胞裂解液制备细胞总蛋白，严格按Bradford蛋白分析系统按规定的操作顺序检测细胞蛋白浓度，取等量总蛋白上样进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜24h，5%脱脂牛奶室温下封闭60min，然后加入各种一抗4℃过夜，之后再加入相应二抗室温下作用60min，TBST洗涤加入ECL显影剂，上扫描机扫描。

1.7 裸鼠皮下成瘤实验 40只裸鼠均为雄性，4～6周龄，体重18～20g；右后肢皮下接种肿瘤细胞，6d以后，挑选肿瘤体积100mm3的小鼠24只，并随机分为4组，每组6只，并称量体重；分组后第1天即开始给予小鼠药物注射，4组裸鼠分别给予生理盐水、二甲双胍200mg/(kg·d)、顺铂10.0mg/(kg·d)及二甲双胍联合顺铂进行处理，给药方式为腹腔注射，每72h给药1次。

1.8 裸鼠的体质量及皮下瘤体积的记录 小鼠每次给药时，观察有无死亡小鼠及饮食、毛发、活动等一般状态，定期测量并记录肿瘤的长径、短径并计算体积，肿瘤体积计算方法为：V=1/2L×R2(L为长径，R为短径)直至周期结束。处死小鼠，取出肿瘤称重记录，解剖裸鼠，观察有无肠、肺、肝脏、脑等远隔脏器侵袭转移的发生；瘤体部分组织制作石蜡切片，以备免疫组化。

1.9 统计学方法 采用Origin7.5软件对实验数据进行统计学处理，所有数据以means±SD表示，进行t检验及其他相关统计学分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 二甲双胍抑制体外培养的人骨肉瘤细胞生长增殖活性 MTT法分别测定人骨肉瘤细胞系U2OS和143B经不同浓度二甲双胍(0、5.0、10.0、20.0、50.0mM)分别处理24h、48h、72h，观察以上浓度的二甲双胍分别联合应用5μg/ml、10μg/ml顺铂作用于两种骨肉瘤细胞48h后细胞增殖存活率。两种细胞系的增殖存活率均随着二甲双胍浓度的增加或者处理时间的延长呈下降趋势(见图1)，说明二甲双胍对体外培养的人骨肉瘤细胞具有明显的存活抑制作用，且这种作用呈现一定的剂量—时间依赖效应。

2.2 二甲双胍诱导骨肉瘤细胞凋亡的形态学观察 本研究采用Hoechst33342对经10.0mM 二甲双胍处理48h的U2OS和143B细胞染色，荧光显微镜观察分析。两种细胞的空白对照组在荧光显微镜下呈均匀微弱蓝色荧光，经10.0mM二甲双胍处理48h后的两种细胞系均不同程度呈现显著强于对照组的蓝色颗粒状荧光，部分区域可见代表细胞凋亡的凋亡小体出现(见图2)。

2.3 流式细胞术检测骨肉瘤细胞周期和细胞凋亡 流式细胞术检测二甲双胍作用48h后的细胞周期三个阶段中肿瘤细胞的分布情况，显示二甲双胍引起U2OS细胞阻滞于S期，143B细胞阻滞于细胞周期G0/G1期。提示二甲双胍诱导骨肉瘤细胞周期阻滞具有细胞特异性。Annexin V/PI双染法，经流式细胞仪检测两种U2OS和143B细胞经不同浓度二甲双胍(0、5.0、10.0、20.0、50.0mM)处理48h后的凋亡率。结果显示，不同浓度二甲双胍处理U2OS和143B细胞48h，可以引起细胞凋亡，且凋亡细胞数量随二甲双胍浓度增加而增加，具有明显的剂量依赖关系(见表1)。

2.4 二甲双胍对骨肉瘤细胞凋亡相关基因表达的影响 二甲双胍处理48h后，内部通路(即线粒体介导的凋亡通路)系列信号分子，如抗凋亡蛋白Bcl-xl、Bcl-2等的表达量随二甲双胍浓度的增加而减少，促凋亡蛋白Bax的表达量随二甲双胍处理浓度的增加而明显增加，处于凋亡信号通路下游的PARP则表现出明显的剪切化激活。还发现了细胞色素C释放到细胞质这一凋亡发生的关键事件。

图1 二甲双胍对人骨肉瘤细胞增殖的抑制作用

图2 二甲双胍诱导人骨肉瘤细胞凋亡的形态学观察

组别nG0/G1(%)S(%)G2/M(%) 凋亡率(%)对照组638.6±2.637.7±5.023.7±8.61.10±0.61二甲双胍组10mmol/L652.4±1.926.6±2.721.0±2.1 17.50±0.8220mmol/L669.7±6.111.8±4.6 18.5±3.3 26.18±4.41

2.5 裸鼠皮下成瘤实验 各组小鼠精神状态尚可，摄食尚可，反应较灵敏，食水量基本正常，顺铂治疗组的裸鼠精神稍差，摄食尚可，反应不够灵敏，顺铂联合二甲双胍治疗组的小鼠精神状态比较差，摄食明显少于其他治疗组，各实验组间BALB/C小鼠的生长状态及生活表现总体良好，各组没有出现小鼠死亡(见图3)。

实验过程结束后将所有裸鼠脱臼致死，取出瘤体称重。研究证实单用二甲双胍可以抑制裸鼠体内肿瘤的增殖，但与对照组比较差异无统计学意义(P=0.08)；有效剂量的二甲双胍联合顺铂可以在裸鼠体内抑制人骨肉瘤细胞的生长增殖，与对照组或单用顺铂组比较，差异有统计学意义(P<0.05，见表2、3)。二甲双胍单用组肿瘤转移灶的大小及数目无显著差异。

表2 二甲双胍治疗前、后各组裸鼠的体重

表3 二甲双胍对裸鼠皮下瘤的影响

3 讨论

骨肉瘤的治疗是当今医学界所面临的重要挑战之一。由于骨肉瘤本身所具有的生物学特性，使其成为目前尚缺乏有效治愈手段的疾病之一。作为最经典的抗糖尿病药物之一，二甲双胍具有多重降糖机制。近年来，二甲双胍因其在抗肿瘤研究中巨大潜力而备受关注[5]。国内外陆续有文献报道二甲双胍对多种体外培养的肿瘤细胞具有抑制作用，如肺癌[6-7]、大肠癌[8]、神经胶质瘤[9-10]等。本实验运用免疫荧光实验、流式细胞术、免疫印迹实验等探讨二甲双胍对骨肉瘤细胞系U2OS、143B细胞增殖活性及对细胞周期及细胞凋亡的作用及机制。建立裸鼠荷肿瘤模型，观察二甲双胍对肿瘤在裸鼠体内的抑制作用。研究结果显示二甲双胍可抑制人骨肉瘤U2OS和143B细胞的增殖活性，且抑制作用具有一定的浓度依赖性和时间依赖性。通过荧光显微镜观察二甲双胍(10mM,48h)处理组的两种骨肉瘤细胞系呈现出明显强于对照组的颗粒状蓝色荧光，且能够找到凋亡小体的影像。Annexin V/PI双染法显示不同浓度二甲双胍处理U2OS和143B细胞48h能显著诱导细胞骨肉瘤细胞凋亡。Western Blot方法进行检测发现，外部通路(即死亡受体介导的凋亡通路)[11-12]的主要信号分子Fas和Fas-L的表达量在二甲双胍诱导人骨肉瘤细胞系U2OS和143B的凋亡中并没有发生明显变化；内部通路(即线粒体介导的凋亡通路)所涉及的信号分子，如抗凋亡蛋白Bcl-xl、Bcl-2等的表达量均随二甲双胍处理浓度增加而明显减少，促凋亡蛋白Bax的表达量随二甲双胍处理浓度增加而明显增加，处于凋亡信号通路下游的PARP则表现出明显的剪切化激活。还发现了细胞色素C释放到细胞质这一凋亡发生的关键事件。这些结果较为详细地揭示了二甲双胍在体外主要是通过内部通路(即线粒体介导的凋亡通路)[13-14]途径来诱导人骨肉瘤细胞发生凋亡的机制。

图3二甲双胍对人骨肉瘤细胞增殖生长影响的体内研究

二甲双胍体内的抗肿瘤实验报道较少，如Xiong等[15]报道较低剂量的二甲双胍单用或联合应用顺铂均能抑制荷肝癌裸鼠肿瘤的体内生长。李学玲等[16]报道二甲双胍能够抑制裸鼠肺腺癌抑制瘤的增殖活性，单用二甲双胍抑瘤率为5.12%，顺铂组抑瘤率为22.8%，顺铂联合应用二甲双胍组抑瘤率为31.0%。目前国内尚未见有关于二甲双胍抑制裸鼠荷骨肉瘤抑制瘤生长增殖的报道。本组体内试验部分发现有效剂量的二甲双胍联合顺铂可在裸鼠体内抑制人骨肉瘤细胞系143B细胞生长增殖，与对照组或单用顺铂组比较，差异有统计学意义。

目前二甲双胍抗肿瘤作用研究主要集中于实验室研究，所用二甲双胍浓度显著高于临床糖尿病患者所用剂量，患者能否耐受如此大剂量二甲双胍尚需大量的临床试验。