同步荧光法测定酱油与食醋中苯甲酸的含量

吴晓红，王 鹤，邵晓丽，陈媛媛

(江苏经贸职业技术学院，江苏 南京 211168)

苯甲酸作为防腐剂，在食品工业中广泛使用，但过多摄入会对肝脏、肾脏等产生毒害作用[1]。《食品添加剂使用标准》[2]中规定，酱油和醋中苯甲酸与苯甲酸钠总量不得超过最大使用量1.0 g/kg(以苯甲酸计)，苯甲酸含量的准确测定显得尤为重要。

目前国标[3]中苯甲酸的测定方法是高效液相色谱法和气相色谱法，但这两种方法都需要昂贵大型仪器，而且样品前处理所用试剂毒性大，步骤复杂，成本高。目前文献报道测定食品中苯甲酸的方法还有紫外分光光度法[4]、荧光光谱法[5]、薄层色谱法[6]、酸碱滴定法[7]等，不同方法各有优点，但样品处理都需要经过萃取或蒸馏，步骤繁琐，并存在不同程度的干扰，回收率不高。同步荧光法具有选择好、方法简单、不需要分离待测组分等特点，本研究尝试用同步荧光法测定酱油和食醋中的苯甲酸含量，以期能够为准确、快速、低成本测定酱油和食醋中的苯甲酸提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

F-280荧光分光光度计，天津港东科技发展股份有限公司；pH-3C 酸度计，上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.2 材料

实验试剂：苯甲酸、氢氧化钠、浓盐酸，均为分析纯；二次蒸馏水。

实验试样：超市购某品牌酱油和食醋。

2 实验方法

2.1 苯甲酸标准曲线的测定

准确称取苯甲酸0.1000 g，加0.1 mol/LNaOH溶液100 mL溶解，转移至1000 mL的容量瓶中，用蒸馏水定容，配成0.1000 g/L苯甲酸标准溶液。准确移取0.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL 0.1000 g/L的苯甲酸标准溶液分别放入6个100 mL容量瓶中，加入3.50 mL 0.1 mol/L的HCl溶液，加蒸馏水定容至刻度。测定各标准溶液的同步荧光光谱，记录272 nm处的荧光强度I，以扣除空白溶液后的荧光强度对标准溶液浓度C作图，进行线性拟合，得到苯甲酸的标准曲线。

2.2 标准加入法进行样品测定

准确移取0.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL 0.1000 g/L 苯甲酸标准溶液分别放入6个100 mL的容量瓶中，各加3.50 mL 0.1 mol/LHCl溶液和1.00 mL试样，再加蒸馏水至刻度，测定各溶液的同步荧光光谱，记录272 nm处荧光强度I。以荧光强度I对标准溶液的浓度C作图，进行线性拟合，得到样品的标准加入法曲线。横坐标上的截距数值上即为1.00 mL试样稀释至100 mL后苯甲酸的浓度。

3 结果与讨论

3.1 实验条件的确定

3.1.1 荧光光谱

通过改变狭缝大小扫描同一标准溶液的荧光光谱，根据曲线平滑程度及灵敏度情况，确定仪器的最佳扫描条件，激发与发射波长狭缝均为20 nm，扫描速度为480 nm/min。

以230 nm作为激发波长，从250～350 nm进行扫描，测得苯甲酸荧光发射光谱如图1，最大发射波长290 nm。以最大发射波长290 nm为固定发射波长，改变激发波长进行扫描，测得苯甲酸荧光激发光谱如图2，激发荧光峰在238 nm和280 nm。可见，苯甲酸在实验条件下发射一定强度的荧光。

图1 苯甲酸荧光发射光谱

图2 苯甲酸荧光激发光谱

3.1.2 Δλ的选择

图3 不同Δλ的苯甲酸的同步荧光光谱

采用同步荧光法测定苯甲酸时，光谱形状不仅与物质本性有关，且与激发波长和发射波长的波长差Δλ有关，当Δλ与发射峰、激发峰之间的波长差相匹配时，才能产生比较强的荧光信号。本实验分别测定了Δλ为30、40、50 nm 时苯甲酸标准溶液的同步荧光光谱，从图3可以看出，Δλ为30 nm 时苯甲酸的同步荧光光谱的荧光强度最大，且能够与其它荧光峰分离开，因此在实际测定中选择了Δλ为30 nm，此时最大激发波长为272 nm。

3.1.3 最佳pH值的确定

图4 苯甲酸荧光强度随pH变化曲线

准确移取4.00 mL0.1000 g/L苯甲酸标准溶液于9个100 mL容量瓶中，用0.1 mol/LHCl调节试液的pH值，加蒸馏水至刻度，摇匀，用酸度计准确测定其pH值，并测定其同步荧光光谱，记录272 nm处荧光强度I。以荧光强度I对pH值作图，见图4，可以看出当溶液的pH值较大时(大于5.0)，苯甲酸溶液的荧光发射强度几乎为零，当溶液pH值较小时(小于2.0)，苯甲酸溶液的荧光发射强度随着pH值的减小逐渐减弱，而当pH值在2.0～3.0范围内苯甲酸溶液荧光强度较大，因此测定的最佳pH值的范围应为2.0～3.0之间。本实验选用pH值2.7的体系溶液，此体系加入的0.1 mol/LHCl溶液体积为3.50 mL。

3.2 苯甲酸标准曲线的线性分析

图5 苯甲酸标准曲线

以2.1方法得到的拟合曲线，如图5，可以看出在Δλ=30 nm时扫描各浓度标准溶液得到的同步荧光光谱中，苯甲酸标准溶液272 nm处的荧光强度与其浓度呈良好的线性关系，其线性方程为I = -0.00714+ 4.496 C，线性相关系数R=0.9998。

3.3 苯甲酸标准加入法测定样品

(a-标准溶液，b-酱油样品，c-食醋样品)

按照2.2测定方法对酱油和食醋样品进行测定，同步荧光光谱图见图6，由图可见，样品峰形和最大荧光峰与苯甲酸标准溶液的基本一致，可推断样品中其它共存成份不干扰苯甲酸的测定。标准加入法测得样品的标准加入曲线，线性方程、线性相关系数及横坐标截距见表1，由此可知苯甲酸的荧光强度I与标准溶液的加入量Vs呈良好的线性关系。根据公式Cx=-CsVs/Vx,可求算出样品中苯甲酸的含量。其中Cx-样品中苯甲酸的含量；Cs-所加苯甲酸标准溶液的浓度；Vx-加入样品的体积；Vs-外推法所得标准溶液的体积。试样中苯甲酸含量和精密度(n=3)见表1。

表1 标准加入法测得线性方程、相关系数及苯甲酸的含量

3.4 重复性实验

取同一酱油样品，按照2.2方法配制6组标准加入溶液，在相同的测定条件下，测得6份苯甲酸的含量，计算出相对标准偏差为1.2%，说明该法重复性好。

3.5 苯甲酸的加标回收实验

取100 mL试样，向其中加入已知量的苯甲酸标准溶液，混匀，用标准加入法测定苯甲酸的含量，并计算回收率。回收率计算公式如下，测定结果见表2。

表2 回收率测定结果

从表2的数据可知酱油和食醋样品中苯甲酸的加标回收率在88.0%至92.0%之间，说明同步荧光法测定酱油和食醋样品中的苯甲酸含量是可靠的。

3.6 讨论

同步荧光法具有选择性好、灵敏度高、干扰少等特点[8]。当样品中的苯甲酸与其它成分共存时，其荧光激发和发射光谱可能互相重叠，一般的荧光光谱法不能在混合物中将苯甲酸很好的分离，而采用同步荧光法选择合适的波长差，样品可以不经预先分离和掩蔽，直接测定苯甲酸的含量。

建立了用同步荧光法测定酱油和食醋中苯甲酸含量的方法，确定了最佳实验条件，苯甲酸在pH值为2.7溶液中，波长差Δλ为30 nm时测得同步荧光光谱最大激发波长为272 nm，在272 nm处苯甲酸的荧光强度与浓度呈良好的线性关系，相关系数为0.9998。样品中苯甲酸的同步荧光峰位置及峰形与标准溶液的基本一致，可认为样品中共存物质不干扰苯甲酸的测定。

对于复杂样品，采用标准加入法可以消除基体干扰，用此法测定了酱油和食醋样品中苯甲酸的含量，回收率在88.0%至92.0%之间，测定方法可靠。另外，本法测定样品的精密度高，重现性好，方法简单，测定快速，令人满意。