不同大小动态载荷对牙周膜细胞线粒体发育及功能的影响

贾如 衣颖杰 刘洁

[摘要]目的：探讨不同大小的动态载荷下人牙周膜细胞（hPDLCs）中线粒体发育和功能水平的变化。方法：体外分离因正畸治疗需要而拔除的健康前磨牙的牙周膜组织，培养健康的hPDLCs。利用动态流体静压加力装置加载0～50kPa、0～90kPa、0～150kPa的周期性动态压应力1d，3d，5d。采用MTT检测其对细胞增殖活性的影响，采用实时定量PCR分别检测线粒体发育及功能相关基因的RNA表达水平。结果：与未受力组细胞相比，0～50kPa、0～90kPa组hPDLCs中线粒体发育相关基因PGC-1α、TFAM、NRF1及线粒体功能相关基因Cox7a1、Cox8b RNA表达水平增加，而0～150kPa组hPDLCs中以上线粒体发育及功能相关基因RNA表达水平则显著降低。结论：适当的机械应力刺激条件能增加人牙周膜细胞中线粒体发育水平并促进其功能，而过大载荷则会抑制线粒体的发育及生理功能的发挥。

[关键词]人牙周膜细胞;周期性应力;动态流体静压加力装置;线粒体发育;线粒体功能;氧化应激

[中图分类号]R329.2    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2019）11-0086-04

Abstract： Objective  To investigate the changes of mitochondrial development and function in human periodontal ligament cells （hPDLCs） under different dynamic loads. Methods  The periodontal ligament tissues of healthy premolars extracted for orthodontic treatment were isolated in vitro， and healthy hPDLCs were cultured. Cyclic dynamic compressive stresses of 0-50kPa， 0-90kPa and 0-150kPa were loaded by dynamic hydrostatic pressure device for 1， 3 and 5 days. MTT was used to detect its effect on cell activity， and real-time quantitative PCR was used to detect the expression level of mitochondrial development and function-related genes. Results  Compared with the cells in the non-stressed group， the expression levels of mitochondrial development genes PGC-1α， TFAM， NRF1 and mitochondrial function-related genes Cox7a1 and Cox8b increased in the 0-50kPa and 0-90kPa groups， while the expression levels of mitochondrial development and function-related genes decreased significantly in the 0-150kPa groups. Conclusion  Proper mechanical stress stimulation can increase the level of mitochondrial development and promote its function in human periodontal ligament cells， while excessive loading can inhibit the development and physiological function of mitochondria.

Key words： hPDLCs; dynamic loads; dynamic hydrostatic pressure device; mitochondrial development; mitochondrial function; oxidative stress

機械刺激是影响牙周支持组织代谢的重要调控因子，适度的牵张应力刺激可以刺激骨组织自身的生长并进行重建，达到骨代谢平衡的目的[1-2]。机械刺激作用的口腔靶组织-牙周膜是牙周支持组织中最为重要的组成部分之一。临床中的应力刺激通过牙体硬组织传导到牙周膜组织后，人牙周膜细胞（Human periodontal ligament cells，hPDLCs）感知疼痛压力并调整肌肉关节运动，而其分泌功能也发生改变，进而引起牙骨质及牙槽骨的吸收或重建[3-4]。适当的机械负载力对牙周组织是一种功能刺激。但过大的机械刺激则可能会引起牙槽骨的破坏吸收以及创伤性牙周炎的发生。近年来，许多学者发现，骨质疏松症、牙周炎和许多全身性疾病都有显著相关性，并提出了这些疾病可能的共同发病机制-氧化应激[5-6]。而线粒体作为细胞能量代谢的场所，其氧化磷酸化是活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的重要来源。线粒体活性氧通过改变氧化还原反应的状态来调节信号，从而决定干细胞的自我更新和分化[7]，过量的ROS会诱导氧化应激反应，破坏线粒体的呼吸链，引起线粒体功能障碍[8-9]。

然而，目前关于hPDLCs在不同大小的动态载荷下的氧化应激状态及其机制的研究尚未见报道。本研究分离培养了健康hPDLCs，探讨不同大小的机械应力刺激对hPDLCs氧化应激及线粒体发育与功能的影响，以期更好地抵抗机械应力刺激下的氧化应激，从而有益于牙周组织的健康。

1  材料和方法

1.1 材料：胎牛血清（美国，Gibco），α-MEM培养基（美国，Hyclone），I型胶原酶（美国，Sigma），0.25%胰蛋白酶（美国，Sigma），青、链霉素（美国， Sigma）， DMSO（美国，Sigma），RNA抽提试剂盒及逆转录试剂盒（日本，TAKARA），q-RTPCR引物（北京奥科生物技术有限公司），syber Green荧光定量PCR检测试剂盒（日本，TAKARA）。

1.2 样本收集与细胞分离培养：所有hPDLCs来源的牙齿样本来源均采集于西安交通大学口腔医院牙槽外科就诊患者因正畸需要减数拔除的健康前磨牙，患者知情同意。患者筛选标准为：无高血压、心脏病等全身系统疾病，无肝炎等传染性疾病;年龄16～30岁;患牙无龋、牙髓炎、根尖周炎、牙周炎等牙体及牙周相关疾病。

在超净工作台内，用PBS溶液完善冲洗牙冠及牙根。刮取根中1/3的牙周膜，剪切成小于1mm3的组织块，采用组织块酶消化法培养原代细胞，培养约3～7d后细胞从组织中爬出，当细胞增殖至培养瓶底壁约70%时，将传代的细胞接种于新培养瓶，记为第一代hPDLCs，采用第4代hPDLCs用于实验研究。参照以往研究进行hPDLCs的细胞标志物与生物学特性检测[10]。

1.3 动态载荷实验：取第4代hPDLCs以1×105/ml细胞密度接种。采用动态流体静压加力装置[11]，通入5%CO2，5%O2，90%N2，分别施加频率为0.1Hz，压强为0～150kPa、0～90kPa、0～50kPa的周期性动态压应力，余下1组放入加力舱，但不施加动态压力，作为空白对照，加力时间为每24h加力1h，共计加力5d。

1.4 MTT检测：在加力实验进行的第1、3、5天后，向每孔内加入20μl预配制的MTT溶液，4h后弃去上清，每孔加入150μl DMSO，37℃避光振荡10min，酶标仪上490nm下读数，检测各孔吸光度并计算细胞存活率。

1.5 总RNA提取及cDNA合成：选择第4代hPDLCs消化重懸，用Trizol裂解细胞并提取总RNA。利用Nano Drop微量紫外分光光度计检测所提取RNA的纯度和浓度。用RR036a逆转录试剂盒进行RNA逆转录反应。

1.6 实时定量PCR检测：使用Real-time PCR试剂盒按照RR820说明书配制反应液，每组设置3个复孔，在Applied Biosystems 7500实时定量荧光PCR仪上设置工作程序：预变性阶段为95℃，30s;PCR反应阶段为（95℃ 5s，60℃ 34s）×40循环后停止，所用体系为20μl。引物设计序列如下：PGC-lα（Forward：5-TCTGAGTCTGTATGGAGTG ACAT-3，Reverse：5-CCAAGTCGTTCACATCTAGTTCA-3）;TFAM（Forward：5-CCAAAAAGAC CTCGTTCAGC-3，Reverse：5-ATGTCTCCGGATCGTTTCA C-3）;NRF1（Forward：5'-CCACGTTACAGGGAGGTGAG-3，Reverse：5-TGTAG CTCCCTGCTGCATCT-3）;Cox7a1（Forward：5-CGAGAACCGAGTAGCTGAG AA-3，Reverse：5-ATACAGGATGTTGTCTGTTGTCTGTTGCAC-3）;Cox8b（For ward：5-CCTAAGGCACACATCACTGC-3，Reverse：5-AACGTCACAGAGAGC CCAAT-3）;GAPDH（Forward：5-GTCTTCACCACCATGGAGAA-3，Reverse：5-ATCCACAG TCTTCTG GGTGG-3）。

1.7 统计学分析：本论文中所有数据统计分析均使用SPSS 19.0进行统计学分析。对不同加力组与空白对照组的数据采用LSD方差分析，数据均表示为均值±标准差（x?±s），以P<0.05记为差异有统计学意义。

2  结果

2.1 不同大小动态载荷对牙周膜细胞增殖活性的影响：MTT结果显示，在0～150kPa、0～90kPa和0～50kPa的周期性动态压应力作用1d、3d和5d后，各加力组牙周膜细胞存活率较空白对照组无明显改变，差异无统计学意义（P>0.05）。因此可以认为0～150kPa、0～90kPa和0～50kPa的周期性动态压应力作用对hPDLCs细胞增殖活性无明显抑制作用，且不同加力时间点之间的细胞存活率也没有显著差异，说明在此范围内的加力时间对于hPDLCs细胞增殖活性也无明显影响。见图1。

2.2 不同大小动态载荷对牙周膜细胞线粒体发育的影响：Real-time PCR结果显示，在不同大小的周期性动态压应力作用下，牙周膜细胞中线粒体发育相关基因的RNA表达水平并不一致。其中，在0～50kPa及0～90kPa应力作用下，线粒体发育标志基因PGC-1α、TFAM及NRF-1均出现随压应力值升高而表达量逐渐增加的趋势，但差异未见显著性意义;但在0～150kPa的过大压应力作用下，以上线粒体发育标志基因的表达量均出现显著降低，且差异有统计学意义（P<0.05），表明过大咬合力作用会抑制牙周膜细胞线粒体的发育状况。见图2。

2.3 不同大小动态载荷对牙周膜细胞线粒体功能的影响：Real-time PCR结果显示，在不同大小的周期性动态压应力作用下，牙周膜细胞中线粒体功能相关基因的RNA表达水平并不一致。其中，线粒体功能标志基因Cox7a1在0～50kPa及0～90kPa应力作用下出现随压应力值升高而表达量逐渐增加的趋势，并且在0～90kPa时表达量增高达显著性差异;但在0～150kPa的过大压应力作用下，其表达量显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。而另一线粒体功能标志基因Cox8b在不同大小的动态压应力作用下表达量并未出现明显差异。以上结果表明，表明过大咬合力作用会影响牙周膜细胞线粒体部分正常生理功能的发挥。见图3。

3  討论

牙周膜连接牙槽骨和牙骨质，为口内牙齿咀嚼力的主要承担组织。为了便于对牙周膜的生物性能、药物反应、力学及骨代谢相关方面的研究，很多学者对牙周膜细胞的体外培养进行了深入的探索。其中将刮取的牙周膜直接贴壁培养的组织块法、胰酶消化重悬细胞的酶解法以及集两者大成的组织块酶解法，已经成为现在体外hPDLCs原代培养的常规方式[12]。

在生理情况下，牙周膜可以承担一定的咀嚼压力，并保持成骨和破骨的相对稳态。因此在体外牙周膜领域的研究中，探索其受力后生物行为的改变是其重要的研究方向。其中如何在体外对牙周膜细胞实现精确加力，从而建立牙周膜细胞仿生受力模型，一直是学者们研究的重点。根据加力方式的不同，不同学者选择的加力大小也存在着很大差异。有学者通过聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）膜构建三维牙周膜模型，对细胞施加6h的35g/cm2（g/cm2非压强单位，如按1g重物施加于1cm2的平面计算，其施加压强约为9.8Pa）静态重物压力后，发现细胞活性受到显著抑制，而施加6～72h的25g/cm2静物压力后，发现细胞活力较不加力对照组明显增强，且破骨细胞的潜在诱导因子PTHrP、IL-11、IL-8和FGF-2等表达也较不加力组明显增加[13]。另有学者通过自研的可施加最大300psi（1psi≈6.875kPa）压强的流体静压加载装置对牙周膜细胞施加150psi的动态压力，通过实时荧光定量PCR检测了跨膜蛋白家族和一些胶原的表达水平的变化[14]。张旻等通过对咬合压力的有限元分析，得出咬合压力约为300kPa，但其对细胞加力之后，发现90kPa的动态压力对细胞活性有明显促进作用，而150kPa对细胞活性略有抑制[11，15-16]。因此根据实验间歇性压力的加载要求，在张旻等对体外细胞周期性流体静压加力装置研究的基础上，设计了0～50kPa，0～90kPa和0～150kPa的力值分组，以在体外分别模拟牙周膜承受正常力和过大力状态，研究健康和炎性hPDLCs在承受不同范围力学刺激时炎症状态的差异。

新近研究发现，氧化应激的直接和间接参与是导致牙周组织破坏的关键因素，牙周炎不仅是氧化应激相关的全身疾病的局部表现，也可以通过氧化应激来促进这些疾病的进展[17]。氧化应激是由于ROS生成过多，破坏了与抗氧化机制间的平衡，从而导致潜在病理损伤的过程。牙周炎的始动因素是细菌，而细菌对宿主的侵袭又导致了ROS的产生。研究表明线粒体和ROS有着密切的联系，例如间充质干细胞成骨分化过程中，线粒体生物合成增加、氧化作用增强并伴随着抗氧化能力的提高[18]。因此，本研究检测了周期性动态压应力对hPDLCs线粒体发育与功能的影响，发现过大力显著降低了线粒体的发育水平及功能。本研究发现PGC-1α、TFAM及NRF-1等线粒体发育标志基因表达水平在较小及正常力范围的动态负载作用下的hPDLCs中并无显著性改变，表明较小或正常力作用对牙周膜细胞中的线粒体发育功能并没有显著影响。但在过大力作用下，这三个线粒体发育标志基因均出现明显下调，且差异有统计学意义（P<0.05），说明即使该力并未直接影响细胞的增殖活性，但对于其线粒体的发育功能已有显著的抑制作用，表明细胞线粒体生物合成功能受到影响，并推测可能会进一步影响细胞增殖、凋亡与自噬，但尚需进一步验证。而线粒体功能标志基因Cox7a1调控组织中与氧化相关的酶的活性，反映组织或细胞的氧化还原水平。其在正常力作用下的hPDLCs中表达升高，但在过大力下被下调，说明适度的机械刺激有利于线粒体氧化还原功能的发挥，但过大力则会抑制其生理功能的释放。而同样作为细胞色素氧化酶的亚基的Cox8b是线粒体电子转运的末端氧化酶，其在不同力作用下的hPDLCs中表达未见统计学差异，这种差异性表达结果与之前研究的结果一致，分析这可能与其在线粒体氧化还原电子转运中的具体作用位点不同有关[19]。

本研究表明，过大的周期性咬合力影响了线粒体发生与抗氧化防御系统，从而对hPDLCs生物学功能造成损害。其进一步机制有待后续研究阐明，以求为基于hPDLCs的牙周组织维护提供新的理论依据。

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[收稿日期]2019-04-11

本文引用格式：贾如，衣颖杰，刘洁，等.不同大小动态载荷对牙周膜细胞线粒体发育及功能的影响[J].中国美容医学，2019，28（11）：86-89.