前列地尔注射液改善兔耳静脉瘀血皮瓣微循环的研究

韩志强 殷国前 严业勇

[摘要]目的：观察应用前列地尔注射液对兔耳静脉瘀血皮瓣微循环的影响。方法：选取健康普通大耳白兔16只，随机分成生理盐水对照组及前列地尔注射液治疗组，每组8只。麻醉后于左耳背制作大小6cm×3cm的静脉瘀血皮瓣模型。皮瓣成形术后立刻于对照组右耳缘静脉缓慢注入生理盐水2ml，治疗组缓慢注入前列地尔注射2ml（1μg/1ml），每天同一时间点注射一次至实验结束，观察皮瓣外观及皮瓣存活率，分别于术后1、3、5、7d，各组分别随机取1只，切取皮瓣中点处皮瓣组织，HE染色观察红细胞瘀积及炎症细胞浸润等情况，免疫组织化学染色观察皮瓣中VEGF及HIF-1α的表达情况。结果：治疗组皮瓣肿胀情况、瘀血情况均明显较对照组轻。治疗组皮瓣成活率为（90.80±3.27）%明显高于对照组的（67.20±2.59）%，差異有统计学意义（P<0.05）。HE染色结果示治疗组红细胞瘀积及炎症细胞浸润等情况明显较对照组轻;免疫组织化学结果示治疗组皮瓣中VEGF的阳性表达量明显高于对照组，HIF-1α的阳性表达量明显低于对照组。结论：前列地尔注射液通过促进皮瓣组织中VEGF的表达和降低皮瓣中HIF-1α的表达量，促进瘀血皮瓣中新生血管的生成速度及减轻瘀血皮瓣的缺血缺氧双重作用改善瘀血皮瓣的微循环，提高静脉瘀血皮瓣的存活面积。 

[关键词]静脉瘀血;前列地尔注射液;微循环;皮瓣;兔耳模型

[中图分类号]R622    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2019）11-0077-05

Abstract： Objective  To observe the effect of alprostadil injection on microcirculation of rabbit auricular venous congestion skin flaps. Methods  Sixteen healthy rabbits were randomly divided into two groups： the control group（injecting saline group） and the treatment group （alprostadil injection group）， each of 8. After anesthesia， the model of venous congestion skin flap was made on the back of the left ear with the size of 6cm×3cm. The treatment group was injected with alprostadil 2ml（1μg/1ml）， and the control group saline（2ml/flap） through the marginal vein of right ear slowly  after the flap plasty， which were injected at the same time every day until the end of the experiment， the appearance of the flaps and the survival rate of the flaps were observed. On the 1d， 3d， 5d and 7d after operation， one of the flaps was randomly selected from each group. The tissue of the flaps at the midpoint of the flaps was cut. After section， HE staining was used to observe erythrocyte deposition and inflammatory cell infiltration. Immunohistochemical staining was used to observe the expression of vascular endothelial growth factor and HIF-1α in the flaps. Results  All of the flaps were swollen and congested after operation， the swelling and congestion of the flaps in the treatment group were significantly lighter than those in the control group. The survival rate of flaps in the treatment group was （90.80±3.27）%， which was significantly higher than that in the control group（67.20±2.59）%， the difference was statistically significant（P<0.05）. HE staining showed that erythrocyte deposition and inflammatory cell infiltration in the treatment group were significantly lighter than those in the control group. Immunohistochemical results showed that the positive expression of vascular endothelial growth factor in skin flaps of the treatment group was significantly higher than that of the control group， and the positive expression of HIF-1α was significantly lower than that of the control group. Conclusion  Alprostadil injection can improve the survival area of venous congestion flaps by promoting the expression of vascular endothelial growth factor in skin flaps and reducing the expression of HIF-1α in skin flaps， promoting the rate of neovascularization in congested skin flaps and alleviating the hypoxia and ischemia of congested skin flaps.

Key words： venous congestion; alprostadil injection; microcirculation; skin flap; rabbit ear model

皮瓣或肌皮瓣移植是整形外科或创伤外科修复组织缺损最常见也是最基本的治疗方法，被广泛运用于瘢痕挛缩松解、皮肤肿瘤、创伤性皮肤软组织缺损、糖尿病性溃疡、褥疮等组织缺损的修复重建[1-3]。但皮瓣移植术后静脉瘀血是常见的并发症，严重者可发展成为静脉危象，影响皮瓣成活，最终可能导致治疗失败。因此如何减轻皮瓣术后静脉瘀血，改善皮瓣微循环，减少皮瓣缺血缺氧坏死，提高皮瓣成活质量，扩大皮瓣成活面积成为整形或創伤外科医生关注的焦点之一。前列地尔注射液具有抗血小板聚集、抑制血栓形成、扩张血管、改善微循环、保护细胞、防止组织损伤等众多生理学和药理学作用特点[4-8]，通过其改善心肌的缺血缺氧广泛应用于心血管疾病的治疗[9]，如治疗缺血性心脏病[10-11];外周动脉闭塞性疾病的治疗[12];防止肾血管血栓形成、改善肾脏缺血缺氧，预防造影剂肾病（CIN）的发生[13-15]，改善糖尿病肾病的肾功能[16]，且效果肯定，但应用于改善静脉瘀血皮瓣的微循环报道甚少。本实验通过建立兔耳静脉瘀血皮瓣模型，探讨前列地尔注射液对静脉瘀血皮瓣微循环的影响，观察前列地尔注射液对静脉瘀血皮瓣成活的保护作用。

1  材料和方法

1.1 主要实验试剂及仪器：前列地尔注射液（北京泰德制药股份有限公司），兔抗人VEGF IgG单克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）、兔抗人HIF-1α单克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）、通用型二步法免疫组化检测试剂（PV-9000）（北京中杉金桥生物公司）、抗原修复液（Ethylenediamine tetra.acetic acid，EDTA）（北京中杉金桥生物公司）、PBS缓冲液（北京中杉金桥生物公司）、浓缩型DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物公司）、封闭用山羊血清工作液（北京中杉金桥生物公司）、Olympus-B X50 显微镜（Olympus 公司，日本）。

1.2 实验动物及分组：健康普通大耳白兔16只，雌雄不限，体质量（2.5±0.5）kg（广西医科大学动物实验中心提供），随机分为生理盐水对照组、前列地尔注射液治疗组，每组8只。

1.3 实验设计：术前用氯胺酮及盐酸塞拉嗪等比例混合后按0.2ml/kg体重肌肉内注射麻醉。麻醉成功后，将实验兔固定于兔台上，于兔左耳背部设计以耳后动脉为蒂大小为6cm×3cm的轴型皮瓣（蒂宽1cm，见图1）。术区碘伏消毒后铺无菌巾，沿设计线全层切开皮瓣，达软骨膜表面，从皮瓣远端向近端于软骨膜表面剥离，皮瓣彻底止血。借用光学显微镜，仔细分离皮瓣蒂部的耳后动、静脉及伴随神经后结扎离断静脉及神经，仅保留耳后动脉，制成以耳中央动脉为唯一血供，1cm宽的蒂部为唯一静脉回流途径的经典静脉瘀血皮瓣模型。检查创面无明显出血用 3-0丝线间断原位缝合（见图1）。皮瓣成形术后立刻于对照组右耳缘静脉缓慢注入生理盐水2ml，治疗组缓慢注入前列地尔注射2ml（1μg/1ml），每天同一时间点注射一次至实验结束。定期观察皮瓣变化。实验动物均由专人饲养，饲养场地、饲料及人员由广西医科大学动物实验中心提供。实验所用器械及材料均经过严格消毒且整个过程均在无菌条件下进行。为减少手术操作带来的误差，所有手术均由1人完成。

1.4 观察指标

1.4.1 大体观察：术后定期观察并记录实验兔的精神状态及饮食情况，观察皮瓣的颜色变化、肿胀程度、有无感染及坏死变化情况，并做相应记录、拍照。

1.4.2 皮瓣成活面积：术后7d测量瘀血皮瓣成活面积，观察各组间皮瓣存活情况。用标准网格试纸测量皮瓣成活面积、总面积。将皮瓣总面积减去成活区面积即可得到坏死区域的面积。计算皮瓣存活率。成活率=皮瓣存活面积/皮瓣总表面积×100%。

1.4.3 HE染色组织学观察：术后1、3、5、7d，各组分别随机取1只于皮瓣中点处切取5mm×5mm全层皮肤组织，10%甲醛固定后石蜡包埋，切取片厚4μm，常规苏木精-伊红染色，观察红细胞瘀积及炎症细胞浸润等情况。

1.4.4 免疫组织化学染色观察：采用免疫组织化学染色检测皮瓣成形术后1、3、5、7d切片组织中VEGF的表达情况，以真皮下毛细血管内皮细胞胞浆中有棕黄色颗粒为阳性细胞标准。免疫组织化学Envision二步法检测术后1，3、5、7d切片组织中缺氧诱导因子1α（HIF-1α）的表达情况，HIF-lα以细胞质呈棕黄色或黄色为阳性，有时亦见于包膜，细胞核偶见染色。

1.5 统计学分析：所有实验数据结果以均数±标准差（x?±s）表示，采用SPSS 19.0进行统计学分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1 大体观察：实验兔麻醉苏醒后，精神状态较差，偶尔自行饮水，未见进食;术后1d，进食、饮水、精神状态基本恢复至术前状态。术中观察发现，皮瓣成形术后所有皮瓣创缘均有渗血，明显肿胀，皮瓣远端颜色暗红，瘀血形成;术后第1天观察发现对照组皮瓣颜色明显深于治疗组，边缘仍有少许渗血;术后3d治疗组皮瓣肿胀情况、瘀血情况均明显较对照组轻，治疗组远端瘀血范围较前缩窄，且边界渐清晰;术后7d皮瓣肿胀消退，坏死区域边界较清楚，对照组皮瓣坏死范围明显大于治疗组（见图2）。所有皮瓣均无伤口感染、脓肿形成、血肿形成、伤口裂开等情况。

2.2 皮瓣成活情况：治疗组皮瓣存活率为（90.80±3.27）% [（16.32±0.58）cm2/18cm2]明显高于对照组的（67.20±2.59）% [（12.08±0.46）cm2/18cm2]，差异有统计学意义（P<0.01）。

2.3 HE染色组织学观察：对照组：皮瓣术后第l、3天，真皮内毛细血管及微静脉内可见大量红细胞聚集，单核及中性粒细胞附壁，可见皮下微静脉内血栓;术后第5天可见红细胞聚集变性含铁血黄素释放染成淡黄色，红细胞聚集逐渐消散。术后7d毛细血管及微静脉内红细胞聚集程度有所减轻，无红细胞瘀积现象，皮肤层次清晰，其中可见少量新生血管。治疗组：术后第1、3天可见部分扩张的管腔内少量红细胞聚集，未见血栓形成;术后第5、7天毛细血管及微静脉内红细胞聚集消散，血管增生较为明显，分布较密集，管腔较小。见图3。

2.4 免疫组织化学染色观察VEGF和HIF-1α的变化情况

2.4.1 VEGF表达情况：VEGF的表达以真皮下毛细血管内皮细胞胞浆中有棕黄色颗粒为阳性细胞标准，同一时间点治疗组的VEGF阳性表达率明显高于对照组。见图4。

2.4.2 HIF-lα蛋白表达情况：HIF-lα蛋白主要定位在血管内皮细胞以及成纤维细胞内，表现为棕黄色颗粒分布于胞浆内，颜色从浅黄色到深棕色。同一时间点治疗组皮瓣中HIF-1α阳性表达率明显低于对照组，即同一时间点对照组缺血缺氧程度比治疗组严重。见图5。

3  讨论

皮瓣移植术是整形或创伤外科修复创面及组织缺损最常用也是最基本的方法，但皮瓣移植后常出现静脉瘀血等并发症，表现为血液瘀积于小静脉和毛细血管内，皮瓣外观肿胀、呈紫色的临床现象[17]。如果皮瓣静脉瘀血没有被及时纠正，最初会导致皮瓣组织的组织间隙压力持续增高，继发毛细血管血流变慢，红细胞积聚、血小板及纤维蛋白原沉积和血液成分的溢出，进一步发展为静脉危象，随后形成的微血栓就会导致皮瓣供血不足导致皮瓣部分或全部坏死，根据皮瓣坏死的面积情况，通常需要长时间换药，再次手术清创、植皮或者转移局部皮瓣来修复创面，给患者造成巨大的身心损害及经济负担。因此如何解决皮瓣术后静脉瘀血影响皮瓣成活率这一棘手问题成为整形或创伤外科医生研究的热点。在临床治疗中曾采取水蛭疗法[18]、小切口引流、抗凝溶栓药物[19]、高压氧[20]、血管扩张剂、负压吸引[21-22]以及最新的细胞和基因治疗[23]等。纵然有这么多种方法供临床选择，但也都存在着各自的局限性，仍不可避免的会在临床上遇到因静脉瘀血而引起的皮瓣部分甚至完全坏死的情况。

前列地尔注射液以脂微球为药物载体的静脉用注射用前列地尔制剂，其主要成分是前列腺素E1（PGE1），具有抗血小板聚集、抗血栓形成、舒张血管平滑肌、保护细胞、改善微循环等诸多生物学功能[9，24]，其由于脂微球的包裹，使前列地尔不易失活，还具有易于分布到受损血管部位的靶向特性，比传统制剂具有更好的被动靶向性、持续性、高效等用药安全性等特点，从而更好地发挥扩张血管、抑制血小板凝集、抗血栓形成的作用[25]，相关研究还发现，前列地尔注射液能促进血管内皮生长因子（VEGF）的表达[26-27]，而VEGF是一种特异性作用于血管内皮细胞的生长因子，能促进血管增生、转移和分化新的血管，从而提高皮瓣的成活面积[28-29]。依据静脉瘀血皮瓣的微循环障碍、有血栓形成等病理表现，通过抗血栓形成改善皮瓣缺血缺氧的同时促进新生血管生成是有效改善皮瓣瘀血的方法。

本实验通过应用Miyawaki等[30]在2002年提出的运用兔耳建立静脉瘀血皮瓣的模型，研究前列地尔注射液对于改善静脉瘀血的作用。Miyawaki最终选择蒂部宽度为lcm的兔耳皮瓣模型进行后期的实验研究，每只实验兔均采用左侧兔耳（右侧兔耳用于药物注射），由于Miyawaki制作的静脉瘀血皮瓣模型简单、重复性好，术中切断了耳部神经以减少术后疼痛对皮瓣成活的影响，曾多位研究者采用此瘀血模型进行瘀血皮瓣的研究[31-32]。本实验结果显示局部注射前列地尔注射液能明显加快兔耳皮瓣消肿及瘀血的消散速度，减轻瘀血皮瓣中红细胞瘀积及炎症细胞浸润，提高皮瓣成活率。通过检测同一时间段皮瓣中VEGF蛋白的表达情况发现，治疗组皮瓣中VEGF的阳性表达量明显高于对照组，这与Tang J[26]、Inoue H等[27]的研究结果是一致的。表明前列地尔注射液可以通过增加皮瓣中VEGF的表达量，加快瘀血皮瓣中新生血管的生成速度，使皮瓣与创基缘之间早期建立血运关系，从而促进瘀血皮瓣的成活率。

本实验通过检测皮瓣中HIF-1α蛋白的表达情况还发现，同一时间点治疗组皮瓣中HIF-1α的表达量明显低于对照组，缺氧诱导子-1α（HIF-1α）是缺氧条件下广泛存在于哺乳动物和人体内的一种转录因子，其表达最主要的调控因素是氧浓度，在常氧状态下，各组织HIF-lα表达甚少，在低氧下情況下HIF-lα表达增加，其表达量的变化可方便、客观、及时的反映瘀血皮瓣组织的缺血缺氧程度[33-34]。从本实验结果可以说明治疗组皮瓣缺血缺氧程度明显较对照组轻，这与Haider DG等[35]的结果是一致的。皮瓣转移后，前列地尔注射液通过其易于分布到受损血管部位特有的靶向特性，分布在皮瓣切缘及周围发挥其扩张血管、抑制血小板凝集、抗血栓形成的作用，减少皮瓣内血液瘀积，防止微循环继续恶化，及时改善了皮瓣组织细胞缺血、缺氧，避免了大量微血栓的形成，继而提高瘀血皮瓣的成活面积。组织学观察结果也证实了治疗组皮瓣红细胞聚集及血栓形成情况较对照组轻，为前列地尔注射液治疗皮瓣瘀血提供了理论支持。

综上所述，本试验初步证实前列地尔注射液通过增加皮瓣组织中VEGF的表达和降低皮瓣中HIF-1α的表达量，促进瘀血皮瓣中新生血管的生成速度及减轻瘀血皮瓣的缺血缺氧双重作用以达到改善瘀血皮瓣的微循环，提高静脉瘀血皮瓣的存活率。因此笔者认为静脉注射前列地尔注射液是一种改善瘀血皮瓣微循环的有效方法，但对于其最佳剂注射剂量及注射时间点有待进一步研究探讨。

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[收稿日期]2019-03-27

本文引用格式：韓志强，殷国前，严业勇.前列地尔注射液改善兔耳静脉瘀血皮瓣微循环的研究[J].中国美容医学，2019，28（11）：77-82.